翁沛華

廣州市第一人民醫(yī)院(廣州 510180)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，化療是各期病程的乳腺癌治療的重要手段，乳腺癌的化療藥物也得到了不斷的發(fā)展和補(bǔ)充。阿霉素是目前臨床乳腺癌治療中廣泛應(yīng)用的化療藥物之一。然而，約有70%的乳腺癌患者對(duì)其耐藥或很快出現(xiàn)化療耐藥。miRNA通過與靶基因mRNA分子的3端非編碼區(qū)(3’UTR)結(jié)合，抑制基因表達(dá)，參與調(diào)控生物生長和發(fā)育等過程。其中，miR-128被報(bào)道與許多腫瘤發(fā)生發(fā)展和耐藥相關(guān)，然而其在乳腺癌阿霉素耐藥中的作用和具體機(jī)制仍不明確。此外，多數(shù)靶向藥物或小分子因?yàn)闊o法實(shí)現(xiàn)在腫瘤部位的靶向聚集并滲透到腫瘤內(nèi)部，導(dǎo)致治療乳腺癌效果不佳。超聲-微泡攜帶藥物或基因靶向治療腫瘤是近年來超聲分子影像學(xué)的研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，在腫瘤早期的檢測(cè)和療效評(píng)價(jià)方面具有可觀的應(yīng)用前景。因此，探索超聲-微泡介導(dǎo)miR-128在乳腺癌阿霉素中的作用和具體分子機(jī)制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

胎牛血清和RPMI 1 640培養(yǎng)基購買自GLIBO公司，RNA提取試劑盒購買自AMBION公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR(quantitative PCR，qPCR)試劑SYBR Green購買自Roche，CCK8試劑盒購買自Roche，miR-128和β-actin的PCR引物購買自銳博生物。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和阿霉素耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADM，用含10%胎牛血清的RPMI 1 640培養(yǎng)基并置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，取對(duì)數(shù)期、生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 制備載miR-128陽離子脂質(zhì)微泡

制備陽離子脂質(zhì)微泡，每次實(shí)驗(yàn)前，通過陽離子微泡和miR-128孵育后進(jìn)行DNA瓊脂糖凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)，測(cè)試出二者最佳孵育比例，每次處理細(xì)胞前，按每1 μg質(zhì)粒與107～108個(gè)的微泡的比例共同孵育miR-128和陽離子脂質(zhì)微泡30 min，得到載miR-128陽離子脂質(zhì)微泡。

1.4 轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞以8 103個(gè)/孔濃度接種于96孔板，待培養(yǎng)密度約30%～50%匯合時(shí)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。采用Oligofectamine Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒，選用miR-128過表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按試劑說明書操作。加入轉(zhuǎn)染液培養(yǎng)4小時(shí)后，更換含有10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 qPCR實(shí)驗(yàn)

利用TRIZOL法提取總RNA，根據(jù)Roche逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，使用3步法進(jìn)行qPCR程序擴(kuò)增，預(yù)變性95 ℃，3 min；變形95 ℃，3 s；退火56 ℃，34 s；延伸72 ℃，10 s，共40個(gè)循環(huán)，由2-△△Ct計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)所需引物如下：miR-128,forward:5′-GCCGGCGCCCGAGCTCTGGCTC-3′；reverse：5′-TCACAGTGAACCGGTCTC-3′；β-actin，forward:5′-CTCGCCTTTGCCGATCC-3′；reverse：5′-GGATC TTCATGAGGTAG-TCA-3′。

基于SYBR熒光強(qiáng)度與雙鏈DNA含量之間呈正相關(guān)的原理，實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度來計(jì)算基因表達(dá)。10 μL系統(tǒng)配置如下：

2 SYBR 5 μL

F+R 0.4 μL

cDNA 1 μL

DEPC 3.6 μL

總量 10 μL

注意：避免光照并在冰上操作。每個(gè)反應(yīng)組需要設(shè)置3個(gè)側(cè)孔，miRNA需要以U6作為內(nèi)部參照，共同基因需要以β-actin作為內(nèi)部參照。反應(yīng)條件完成后，使用96孔板或八個(gè)連續(xù)的板來排列和添加樣品，然后將它們放入Bio-Bad熒光定量PCR儀中，反應(yīng)條件：5 ℃ 2 min，(95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)39 個(gè)循環(huán)。

1.6 CCK8實(shí)驗(yàn)

不同的細(xì)胞處理種植在96孔板上，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入阿霉素并培養(yǎng)，利用CCK8檢測(cè)細(xì)胞活性并計(jì)算不同處理細(xì)胞阿霉素的藥物IC50。主要實(shí)驗(yàn)步驟如下：

(1)在96孔板中接種不同處理的細(xì)胞(100 μL/孔)。將培養(yǎng)板先放在培養(yǎng)箱中一段時(shí)間(在37 ℃，5% CO2)；

(2)向每孔加入10 μL 的CCK8溶液(注意孔中不要有氣泡生成)；

(3)將準(zhǔn)備好的培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱內(nèi)1～6小時(shí)；

(4)用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，多組間兩兩比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析，分析前進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-128在阿霉素耐藥乳腺癌細(xì)胞中低表達(dá)

為研究miR-128在乳腺癌阿霉素耐藥中的作用，我們前期構(gòu)建了人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和阿霉素耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADM，并通過qPCR檢測(cè)了miR-128在親代乳腺癌細(xì)胞MCF-7和阿霉素耐藥的乳腺癌細(xì)胞MCF-7/ADM中的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-128在阿霉素耐藥乳腺癌細(xì)胞中低表達(dá)(圖1)，且結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 qPCR檢測(cè)miR-128在阿霉素耐藥乳腺癌細(xì)胞中低表達(dá)(P<0.05)

2.2 超聲-微泡介導(dǎo)miR-128增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性

為驗(yàn)證miR-128在乳腺癌阿霉素耐藥中的作用，我們?cè)谟H代人乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-128，CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MCF-7過表達(dá)miR-128組和對(duì)照組阿霉素IC50的變化，以及檢測(cè)超聲-微泡miR-128組乳腺癌阿霉素IC50的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)miR-128能夠增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性，超聲-微泡介導(dǎo)的miR-128進(jìn)一步增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性(圖2)，且結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 超聲-微泡介導(dǎo)miR-128降低乳腺癌細(xì)胞阿霉素IC50(P<0.05，OE：過表達(dá)，UM：超聲-微泡)

2.3 miR-128通過調(diào)節(jié)PTEN從而抑制乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素耐藥

為研究miR-128調(diào)控乳腺癌細(xì)胞阿霉素敏感性的具體分子機(jī)制，我們?cè)诎⒚顾啬退幦橄侔┘?xì)胞中過表達(dá)miR-128后，qPCR檢測(cè)PTEN的RNA表達(dá)水平。以及在阿霉素耐藥乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-128且過表達(dá)PTEN后，CCK8檢測(cè)阿霉素IC50變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在阿霉素耐藥乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-128后，PTEN的RNA表達(dá)降低(圖3)，且結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 qPCR檢測(cè)過表達(dá)miR-128后PTEN的mRNA水平(P<0.05，OE：過表達(dá))

且阿霉素耐藥乳腺癌細(xì)胞中加入超聲-微泡miR-128且過表達(dá)PTEN后，乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素恢復(fù)抗性(圖4)，且結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 CCK8檢測(cè)超聲-微泡miR-128且過表達(dá)PTEN卵巢癌阿霉素IC50(P<0.05，OE：過表達(dá))

3 討 論

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，化療是治療乳腺癌最重要的手段之一。但多達(dá)50%～70%的患者會(huì)出現(xiàn)顯著的耐藥，嚴(yán)重影響了患者的生存預(yù)后。因此，尋找安全有效的治療方法治療乳腺癌化療耐藥具有重要研究價(jià)值。基于這些原因，根據(jù)國內(nèi)外的研究和前期的研究結(jié)果，我們提出超聲-微泡介導(dǎo)miR-128通過調(diào)節(jié)PTEN抑制乳腺癌細(xì)胞阿霉素耐藥的研究。在既往工作基礎(chǔ)上，結(jié)合國內(nèi)外研究重點(diǎn)，重點(diǎn)研究超聲-微泡介導(dǎo)miR-128特異性靶向乳腺癌化療耐藥，有望為增強(qiáng)乳腺癌化療耐藥提供新的方法，為尋找和解決乳腺癌化療耐藥提供新的理論依據(jù)。我們通過qPCR檢測(cè)miR-128在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)，并利用超聲技術(shù)制備脂質(zhì)微泡探究超聲-微泡介導(dǎo)的miR-128對(duì)乳腺癌細(xì)胞阿霉素耐藥的影響，CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞的活性；qPCR檢測(cè)過表達(dá)miR-128后對(duì)PTEN的影響和對(duì)乳腺癌細(xì)胞阿霉素耐藥的影響。miR-128在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用,可以和RECK相互影響調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為,提示miR-128和RECK可能成為乳腺癌的潛在治療靶標(biāo)[3]。此外，miR-128被證明參與多種腫瘤化療耐藥，余曉玲的研究發(fā)現(xiàn)miR-128能夠靶向Rap1B影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲及化療敏感性[4]。在結(jié)直腸癌中，miR-128基因的超甲基化能導(dǎo)致NEK2的表達(dá)顯著上調(diào)，可能通過對(duì)NEK2的調(diào)節(jié)改變腫瘤細(xì)胞的耐藥型。陳云云研究發(fā)現(xiàn)miR-128與乳腺癌的紫杉醇耐藥性有關(guān)，可以用于判斷患者的紫杉醇耐藥情況[6]。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-128過表達(dá)可以增強(qiáng)乳腺癌對(duì)阿霉素的敏感性。進(jìn)一步在乳腺癌中深入發(fā)現(xiàn)miR-128的作用，為揭示miR-128在乳腺癌中的作用提供了新的思路。載藥超聲-微泡的靶向治療是當(dāng)前醫(yī)藥領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。超聲-微泡破壞技術(shù)介導(dǎo)的靶向藥物和基因治療是一種最新的靶向治療方法。超聲-微泡不僅可以作為一種超聲造影劑增強(qiáng)成像對(duì)比度,更可以通過各種物理、化學(xué)修飾攜帶各種藥物或基因在超聲場(chǎng)強(qiáng)破壞作用下進(jìn)行靶向治療。近年來，應(yīng)用微泡造影劑對(duì)乳腺癌進(jìn)行靶向治療成為超聲分子影像學(xué)研究的重點(diǎn)領(lǐng)域，在早期腫瘤檢測(cè)和治療中具有良好的應(yīng)用前景[7]。微小RNA(microRNA, miRNA)是由20～22個(gè)核苷酸組成的非編碼區(qū)單鏈RNA，通過與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)相互作用，負(fù)向調(diào)控基因表達(dá)，抑制蛋白質(zhì)的合成。前面我們已經(jīng)證明miR-128介導(dǎo)了乳腺癌阿霉素耐藥，因而利用靶向miR-128治療乳腺癌阿霉素耐藥成為了可能。然后，由于miRNA在體內(nèi)易被降解，因此需要載體將其遞送到靶組織，超聲-微泡作為一種非侵入性和組織特異性的基因傳遞技術(shù)，安全性高、穩(wěn)定性好、轉(zhuǎn)染效率高，避免了基因在血液循環(huán)中的降解。Qin等[8]研究了超聲-微泡介導(dǎo)的miR-205在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，發(fā)現(xiàn)超聲-微泡介導(dǎo)miR-205可有效抑制前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。Yang等[9]利用超聲-微泡將miR-let-7b轉(zhuǎn)染到OCSCs中，結(jié)果表明超聲-微泡聯(lián)合miR-128為卵巢癌的基因治療提供了良好的治療策略。因此，利用超聲-微泡載miR-128治療乳腺癌阿霉素耐藥被我們進(jìn)一步研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲-微泡介導(dǎo)的miR-128進(jìn)一步增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性，進(jìn)一步探索超聲-微泡介導(dǎo)miRNA特異性靶向乳腺癌增敏化療療效的研究，盡管超聲聯(lián)合微泡增敏化療的相關(guān)研究目前尚未完全成熟，仍處于臨床應(yīng)用的早期，但其作為一種無創(chuàng)的輔助治療手段，提高了腫瘤局部藥物濃度，具有廣泛的應(yīng)用前景。今后隨著研究的逐漸深入和各項(xiàng)技術(shù)不斷優(yōu)化，其將在臨床中得到更廣泛的應(yīng)用,有望為乳腺癌治療提供新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)方案。