張柏娥 ，戴偉鋒 ，付麗，3 ，趙高瓊 ，崔佳麗，楊宏博

（1.昆明理工大學，云南昆明 650504；2.云南省藥物研究所，云南昆明 650111；3.思維特健康管理有限公司，北京 100010）

頭孢噻肟鈉（cefotaxime Sodium，CTⅩ）是1977年德國制藥公司研發(fā)成功的首個第三代半合成頭孢菌素類抗生素，其抗菌譜廣，對革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、需氧菌和某些厭氧菌均有較好的抗菌活性，特別對革蘭陰性菌的殺滅作用更強，廣泛分布于全身各組織和體液中，臨床主要用于呼吸道感染、尿路感染、胃腸道及膽道感染和眼耳鼻喉感染等，對敗血癥、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、腹膜炎和皮膚軟組織感染等均有很好的療效[1-3]。自1998 年我國制藥公司仿制成功后，已經(jīng)成為我國臨床用抗生素的主要品種[4]。但由于抗生素本身不良反應較多、長期不合理使用產(chǎn)生較強的耐藥性等原因，從而給人類的身體健康造成嚴重威脅[5]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters 高效液相色譜系統(tǒng)Empower 色譜工作站（美國Waters 公司）；BP121S 電子天平（德國賽多利斯股份公司）；LN-9527-01 高速離心機（美國雅培公司）；ⅩW-80A 旋渦混合器（上海精科實業(yè)有限公司）。

1.2 材料

頭孢噻肟鈉（中國食品藥品檢定研究院，批號：CFTZ180063，質(zhì)量分數(shù)：90.6%）；注射用頭孢噻肟鈉（哈藥集團制藥總廠，規(guī)格：0.5 g、1.0 g和2.0 g，批號：130220、130312 和130703）；頭孢拉定（內(nèi)標，中國食品藥品檢定研究院，批號：130427-201707，質(zhì)量分數(shù)：95.7%）；乙腈（色譜純，美國Merck公司，批號：1428130）；乙酸、二氯甲烷、磷酸等試劑均為分析純；超純水利用實驗室超純水機自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Synergi Hydro-RP 80? 柱（4.60 mm×250 mm，4 μm）；流動相：乙腈-20 mmol/L磷酸水溶液（體積比16∶84）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：234 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 標準溶液的配制

2.2.1 頭孢噻肟鈉標準溶液的配制 精密稱取頭孢噻肟鈉對照品55.20 mg 于25 mL 量瓶中，用超純水溶解后，定容至刻度，按含量折算后即得質(zhì)量濃度2.000 mg/mL 的頭孢噻肟鈉儲備液，放置于冰箱中冷藏保存?zhèn)溆?。試驗過程中依據(jù)需要，再將頭孢噻肟鈉儲備液稀釋成5.000、10.00、20.00、50.00、100.0、400.0、800.0、1 200、1 600 μg/mL的標準溶液。

2.2.2 頭孢拉定標準溶液的配制 精密稱取20.90 mg頭孢拉定對照品于25 mL容量瓶中，超純水溶解后，定容至刻度，按含量折算得質(zhì)量濃度為800.0 μg/mL的內(nèi)標儲備液，放置于冰箱中冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血漿樣品處理方法

精密吸取人含藥血漿200 μL，置于離心管中，加入800.0 μg/mL 頭孢拉定溶液20 μL，加入乙腈800 μL，振蕩混合均勻，10 000 r/min 離心5 min，上清液加0.3%乙酸溶液10 μL 調(diào)pH 值至酸性，加入二氯甲烷1 mL，振蕩混合充分，4 000 r/min離心3 min，精密吸取上清液10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄頭孢噻肟鈉峰面積與內(nèi)標頭孢拉定峰面積。

2.4 方法學考察[12]

2.4.1 專屬性試驗 精密吸取不同來源空白混合血漿樣品200 μL，除不加內(nèi)標溶液外，其他與“2.3”項方法操作，按“2.1”項色譜條件進樣，獲得色譜圖1A。

精密吸取不同來源人空白混合血漿樣品180 μL，加入經(jīng)儲備液稀釋的100.0 μg/mL 頭孢噻肟鈉溶液20 μL，按“2.3”項方法操作，再按“2.1”項色譜條件進樣，獲色譜圖1B。

精密吸取1-01 受試者滴注頭孢噻肟鈉1 h 時收集的血漿樣品200 μL，按“2.3”項方法操作，按“2.1”項色譜條件進樣，獲得色譜圖1C。

對于天然餌料，不同的水庫，由于環(huán)境條件、水文情況等不相同，天然餌料的種群數(shù)量和產(chǎn)量也不一樣，有時差別還比較大。天然餌料不豐富的水庫，要通過設置人工魚巢、投放人工培育魚苗（如鯪魚），加大鯉、鯽魚的混養(yǎng)密度等措施，增加雜魚種群密度。

圖1 頭孢噻肟鈉高效液相色譜圖Figure 1 HPLC Chromatograms for CTⅩplasma samples

可見，血漿中頭孢噻肟鈉和頭孢拉定的保留時間分別約為5.9 min 和4.9 min，頭孢噻肟鈉峰和頭孢拉定峰分離度（約為2.5）大于1.5，且不受血漿中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，表明方法專屬性較好。

2.4.2 標準曲線和定量下限 取180 μL 不同來源人空白混合血漿樣品7份，每份分別依次精密吸取加入經(jīng)儲備液稀釋的7個不同質(zhì)量濃度的頭孢噻肟鈉標準溶液各20 μL，按“2.3”項方法進行操作，得質(zhì)量濃度分別為0.500 0、1.000、5.000、10.00、40.00、80.00、160.0 μg/mL 的頭孢噻肟鈉血漿樣品和質(zhì)量濃度為80.00 μg/mL 頭孢拉定血漿樣品。以上各濃度樣品平行操作，按“2.1”項色譜條件進行檢測，建立頭孢噻肟鈉的標準曲線。采用加權(quán)（W＝1/X2）最小二乘法，以頭孢噻肟鈉峰面積與內(nèi)標峰面積比值（Ai）為縱坐標，以頭孢噻肟鈉質(zhì)量濃度（C,μg/mL）為橫坐標，進行線性回歸運算，求得線性回歸方程Ai＝0.026 9C-0.001，R2＝0.998 3。校正標樣回算的濃度均在標示值的±15%，最低定量下限（LLOQ）在±20%。由此可見，頭孢噻肟鈉人血漿樣品在0.500 0～160.0 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，LLOQ為0.500 0 μg/mL，符合體內(nèi)生物樣品分析要求。

2.4.3 精密度和準確度試驗 取空白離心管，精密吸取不同來源人空白混合血漿樣品各180 μL，再分別加入經(jīng)儲備液稀釋的不同質(zhì)量濃度的頭孢噻肟鈉溶液20 μL，按“2.3”項方法進行操作，制成質(zhì)量濃度分別為0.500 0、1.000、40.00、120.0 μg/mL 的頭孢噻肟鈉血漿樣品。每個質(zhì)量濃度血漿樣品平行制備6 份，且在不同天連續(xù)制備3 個分析批次進行測定分析，測定頭孢噻肟鈉峰面積。結(jié)果表明，日內(nèi)、日間精密度RSD 值均小于15%，符合生物樣品檢測要求，見表1。

表1 血漿中頭孢噻肟鈉批內(nèi)、批間精密度和準確度Table 1 Within-run and between-run precision and accuracy of Cefotaxime Sodium in plasma

2.4.4 提取回收率試驗 精密吸取不同來源人空白混合血漿樣品各180 μL，再分別加入經(jīng)標準溶液稀釋的不同質(zhì)量濃度的頭孢噻肟鈉溶液20 μL，按“2.3”項方法進行操作，制備成質(zhì)量濃度分別為低（1.000 μg/mL）、中（40.00 μg/mL）和高（120.0 μg/mL）頭孢噻肟鈉血漿樣品各6 份，測定頭孢噻肟鈉藥物峰面積和內(nèi)標峰面積，并計算其比值，將比值帶入標準曲線方程計算實際質(zhì)量濃度，按下面的公式計算提取回收率：提取回收率＝（測得的質(zhì)量濃度/實際加入質(zhì)量濃度）×100%。結(jié)果表明，頭孢噻肟鈉低、中、高質(zhì)量濃度血漿樣品的提取回收率為90.88%～92.41%，符合生物樣品方法學考察要求，見表2。

表2 頭孢噻肟鈉血漿樣品提取回收率試驗結(jié)果Table 2 The recoveries of CTⅩplasma samples(n=6)

2.4.5 殘留效應 在最高定量限樣本與高濃度樣本測定后，隨之測定空白樣本，評估殘留。結(jié)果顯示，高濃度樣本檢測后，再測定分析空白樣本中的殘留不超過LLOQ 的20%，且同時不超過內(nèi)標的5%，故認為本方法不存在殘留效應。

2.4.6 穩(wěn)定性考察 精密配制質(zhì)量濃度分別為1.000、40.00、120.0 μg/mL 的頭孢噻肟鈉血漿樣品，考察室溫（22±2）℃放置2 h、-80 ℃反復凍融3次和長期冷凍55 d 時頭孢噻肟鈉在血漿樣品中的穩(wěn)定性，以及進樣前室溫（22±2）℃放置12 h 的樣品穩(wěn)定性。結(jié)果表明，以上3 個質(zhì)量濃度的頭孢噻肟鈉血漿樣品，在室溫放置2 h、-80 ℃反復凍融3 次、-80 ℃長期冷凍55 d 和在處理后室溫放置12 h 條件下均較穩(wěn)定，見表3。

表3 頭孢噻肟鈉在人血漿中的穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 3 Stability of CTⅩin human plasma(n=6)

2.5 藥動學研究

2.5.1 志愿者選擇及血漿樣品的收集 本試驗方案經(jīng)解放軍昆明總醫(yī)院批準后實施，共納入18名健康志愿者，年齡（24.25±2.49）a，體質(zhì)量（58.52±8.83）kg，男女各半，無藥物過敏史、藥物依賴史和慢性疾病史，青霉素皮試陰性，試驗前7 d 內(nèi)未服用任何藥品，半年內(nèi)未參加過任何臨床試驗，實驗室檢查各指標合格，均簽署知情同意書，體檢各指標未出現(xiàn)具有臨床意義的異常，符合納排標準入組試驗。

受試者于試驗前一天晚10時開始禁食，試驗當日晨8 時空腹抽取空白血樣后隨機分為3 組，各組分別恒速靜脈滴注0.5、1.0、2.0 g 經(jīng)0.9%NaCl 注射液制備的頭孢噻肟鈉注射液各100 mL，滴注30 min。從開始滴注計時，分別于0.08、0.25、0.50、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0 h 采靜脈血2 mL 至肝素管中，4 ℃保存，3 500 r/min 離心5 min，分離血漿，立即放于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5.2 血藥濃度測定 精密吸取上述滴注頭孢噻肟鈉受試者各時間點收集的血漿樣品200 μL，按“2.3”項方法進行平行操作后，利用上述經(jīng)驗證的色譜條件平行測定各血漿樣品頭孢噻肟鈉濃度。

2.5.3 數(shù)據(jù)處理分析 采用DAS 2.0軟件對測定的不同時間點血藥濃度結(jié)果進行非房室模型（NCA）分析。

2.5.4 藥動學參數(shù) 通過數(shù)據(jù)處理分析，計算平均血藥濃度，建立平均血藥濃度-時間曲線（見圖2）。采用DAS2.0 軟件進行血藥濃度分析，獲得主要藥動學統(tǒng)計矩參數(shù)（見表4），并利用置信區(qū)間法[13]對各統(tǒng)計矩參數(shù)進行統(tǒng)計學分析。可見，隨給藥劑量增加，最大血藥濃度（Cmax）和濃度-時間曲線下面積（AUC0-t和AUC0-∞）值隨之增加；利用置信區(qū)間法分析表明，Cmax和AUC0-t在劑量0.5～2.0 g 范圍內(nèi)β的90%置信區(qū)間分別為0.79～1.21和0.87～1.04，均落在Cmax和AUC0-t的判斷區(qū)間0.70～1.43 和0.80～1.25 范圍內(nèi)，表明頭孢噻肟鈉呈線性動力學特征。

表4 主要藥動學參數(shù)Table 4 The main pharmacokinetics parameters(,n=6)

表4 主要藥動學參數(shù)Table 4 The main pharmacokinetics parameters(,n=6)

圖2 單次靜脈滴注各劑量組頭孢噻肟鈉平均血藥濃度-時間曲線Figure 2 Mean plasma concentration-time curves of different doses of CTⅩafter iv(,n=6)

3 討論

頭孢噻肟鈉因具有抗菌譜廣、治療效果好、毒副作用小等特點，在臨床應用廣泛，而對于其體內(nèi)血藥濃度的監(jiān)測及其藥動學研究國內(nèi)外文獻報道相對較少。本研究建立了一種快速測定頭孢噻肟鈉血漿樣品濃度的HPLC法。為了減少系統(tǒng)誤差對測試樣品濃度的影響，在方法學研究過程中，對每批樣品分析時，將質(zhì)控樣品（1.000、40.00、120.0 μg/mL）均勻分布在未知樣品測試順序中，建立隨行標準曲線，從而保證了檢測樣品的準確性。

本研究建立的HPLC 法，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品的測定，內(nèi)標物頭孢拉定的保留時間約為4.9 min，頭孢噻肟鈉的保留時間約為5.9 min。與熊原等[6]和顧宜等[7]的報道比較，雖然樣品檢測時間大體相同，但樣品前處理比較簡便。另外，也有文獻報道采用內(nèi)標法測定血漿中頭孢噻肟鈉濃度，可能由于選擇內(nèi)標物的原因，使待測內(nèi)標物（分別為咖啡因和3，5-甲苯二酚）檢測完成的保留時間分別為10.6 min和12.26 min[8-9]，樣品整體的檢測時間與本研究的相比，增加約1倍。本研究檢測更加快速的原因可能主要有兩個方面：首先，優(yōu)化了血漿的處理方法，采用乙腈蛋白沉淀，0.3%乙酸溶液調(diào)pH，二氯甲烷除雜，由于選用的試劑及方法合理，測定時雜質(zhì)峰干擾少、靈敏度高，操作也簡便；其次，內(nèi)標物的選擇，無論本研究還是文獻[7，9]報道中，頭孢噻肟鈉的保留時間基本一致，文獻中內(nèi)標物保留時間在頭孢噻肟鈉的保留時間之后，而本研究中選擇的內(nèi)標物頭孢拉定在頭孢噻肟鈉保留時間之前，且內(nèi)標物能與雜質(zhì)峰可完全分離，大大縮短了每個樣品的檢測時間。

本研究采用建立的HPLC法測定了單次給予不同劑量（0.5、1.0和2.0 g）時、不同時間點的頭孢噻肟鈉血藥濃度，并對不同劑量/規(guī)格的藥動學參數(shù)進行統(tǒng)計分析，比較不同劑量間藥動學參數(shù)的差異性，結(jié)果表明隨著給藥劑量增加，Cmax、AUC0-t和AUC0-∞值增加，Cmax和AUC0-t在劑量0.5～2.0 g 范圍內(nèi)β的90%置信區(qū)間分別為0.79～1.21和0.87～1.04，均落在Cmax和AUC0-t的判斷區(qū)間0.700～1.43 和0.80～1.25 范圍內(nèi)，表明頭孢噻肟鈉3個劑量組Cmax和AUC0-t參數(shù)與劑量間具有線性相關(guān)，由此提示在臨床上靜脈注射頭孢噻肟鈉時，應考慮劑量對人體產(chǎn)生的影響。

本研究僅對單次給予不同劑量的頭孢噻肟鈉進行血藥濃度監(jiān)測及藥動學分析，在今后的研究中，可考慮單用頭孢噻肟鈉連續(xù)給藥或與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑組成復方單次/連續(xù)給藥，綜合系統(tǒng)地考察頭孢噻肟鈉在人體內(nèi)的藥動學特點。