劉文華 于小雲(yún) 魏敏 段世航 張長朝 郭東會＊

（山東第一醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安 271016）

黃連別名味連、雞爪連，屬毛莨科、黃連屬草本植物，有清熱解毒的功效，可以降血糖、治療痢疾等。連翹屬木樨科、連翹屬落葉灌木，有清熱、解毒、消腫等功效，可治溫?zé)?、丹毒、斑疹、小便淋閉。

提取總黃酮的方法包括浸提法[1]、超聲法[2]、超臨界流體萃取法[3]、酶提取法等[4]，通過不同的微生物發(fā)酵方法從黃連和連翹中提取黃酮類化合物的文獻較少。此方法通過微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)復(fù)合酶制劑，并利用它們分解植物細(xì)胞壁中的木質(zhì)素和纖維素等大分子物質(zhì)，從而促進析出有效成分。此方法，操作更簡便，花費更少。本實驗采用兩種固體發(fā)酵法方法提取黃酮過程:一為使用黑曲霉或枯草芽孢桿菌單一菌種；二為使用兩種菌混合來。并分析其黃酮的抗氧化活性為黃連和連翹的開發(fā)與使用提供豐富的理論基礎(chǔ)[5]。

1 材料與方法

1.1 試材

黃連、連翹（安國市旭芳中藥材經(jīng)營有限公司），粉碎。黑曲霉、枯草芽孢桿菌由山東第一醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室提供。蘆丁（中國藥品生物制品檢定所）、DPPH（上海源葉生物科技有限公司）、啡啰嗪（阿拉丁試劑）；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 黃酮提取方法的優(yōu)化

1.2.1.1 超聲提取中草藥黃酮。中草藥（黃連或連翹）10g，加乙醇（65mL，60%），30℃、45Hz、功率為50%，超聲（50min），紗布（4 層）過濾。取濾液20mL,用乙醇（60%）將液體定容至100mL，即為中草藥黃酮的提取液，將提取液放入冰箱備用[5]。

1.2.1.2 黑曲霉固體發(fā)酵法輔助提取中草藥黃酮。固體發(fā)酵培養(yǎng)基[6]：黃連（連翹）10g、麩皮10g、蒸餾水35mL, 滅菌（121℃，20min）。接入黑曲霉，搖床（28℃、150r/min 恒溫振蕩）培養(yǎng)7d。后按照超聲提取中草藥黃酮進行實施。

1.2.1.3 枯草芽孢桿菌固體發(fā)酵法輔助提取中草藥黃酮。固體發(fā)酵培養(yǎng)基[7]：黃連（連翹）10g、玉米面3g、豆粕9g、麩皮18g、蒸餾水44mL，滅菌（121℃，20min）。將枯草芽孢桿菌接入培養(yǎng)基，搖床（37℃、150r/min 恒溫振蕩）培養(yǎng)7d。后按照超聲提取中草藥黃酮進行操作。

1.2.2 黃酮濃度的測定。

1.2.2.1 不同濃度蘆丁溶液的測定[8]。蘆丁10mg，用60%乙醇溶解后，轉(zhuǎn)移至50mL 容量瓶，加入60%乙醇稀釋至刻度,0.2g/L 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。在1-6 號容量瓶（10mL）中加入量取好的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分別加入0.3mL 亞硝酸鈉（5%），混勻靜放10min，加入0.3mL 硝酸鋁（10%），混勻靜放10min，加入2mL 氫氧化鈉（1mol/L），用60%乙醇稀釋至刻度測吸光度（510nm）。

1.2.2.2 黃酮濃度的測定[9]。將不同黃酮提取液1mL 加入容量瓶（10mL）中，其他步驟與“1.2.2.1”方法相同。計算黃酮提取液黃酮含量E（mg/g）。E=A×C×V×10-3/W 式中，A 為樣品液測黃酮稀釋的倍數(shù)，C 為經(jīng)蘆丁回歸方程中求得的黃酮量（mg/L），W為重量（g），V 為定容體積（mL）。

1.2.3 黃酮的抗氧化活性研究。

1.2.3.1 黃酮對羥基自由基的清除作用[10]。在試管中按序加入1mL Fe2+（9mmol/L），1mLH2O2（8.8 mmol/L），混勻靜放10min；取不同濃度的樣品溶液2mL，混勻靜放10min，加入1mL 水楊酸-乙醇溶液（9mmol/L），混勻靜放30min，測其吸光值（510nm），其清除率計算公式：

式中：E 為羥基自由基清除率（%）；A0為空白對照液的吸光值；Ax為加入不同黃酮濃度的樣品溶液的吸光值；Aj為不加水楊酸-乙醇的吸光值。

1.2.3.2 黃酮對DPPH 自由基清除作用[11]。在10mL 試管中按序加入不同濃度的黃酮樣品 1mL，0.25mLDPPH 溶液（0.5moL/L），加入乙醇至10mL，避光、37 度靜放20min，測其吸光值（517nm），以乙醇作空白調(diào)零。黃酮對DPPH 的清除率的計算公式：

式中：I 為DPPH 的清除率（%）；A0為空白對照的吸光值；Ax為加入不同黃酮濃度的樣品溶液的吸光值；Aj為不加DPPH的吸光值

1.2.3.3 對Fe2+的抗氧化能力[12]。分別稱取不同質(zhì)量的菌體（10、30、50、70、90、110mg） 加入 3mL 無水乙醇， 添加2mmol/L0.05mL 的硫酸亞鐵溶液混勻，添加5mmol/L 0.2mL 的菲啰嗪，靜放10 分鐘，分光光度計檢測562nm 下測吸光度記作A 樣品，蒸餾水代替樣品作空白對記作A 空白。EDTA 作為陽性對照，實驗方法同上，實驗重復(fù)3 次。

Fe2+的螯合能力=[（A 加樣-A 空白）/A 空白]×100%

1.2.3.4 鐵氰化鉀法進行還原能力的測定[13]。取不同濃度的黃酮樣品溶液1mL 按序加入2.5mL 的磷酸鈉溶液（0.2mol/L）、2.5mL 鐵氰化鉀（1%）,50℃恒溫水浴、暗處反應(yīng)20min,2.5mL 三氯乙酸（10%）。離心（3000r/min，10min），將三氯化鐵（0.1%）0.5mL、雙蒸水2.5mL 及上清液2.5mL 靜放10 分鐘,測定吸光值（700nm）。以蒸餾水代替樣品作空白對照，抗壞血酸作陽性對照,每個樣品需3 組平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 固體發(fā)酵法輔助提取黃酮與“1.3.2.1”的方法相同，由分光光度法得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程（橫坐標(biāo)蘆丁濃度，縱坐標(biāo)吸光度）為：Y=0.1619x+0.1035（R2=0.982）。根據(jù)回歸方程計算不同方法提取黃酮的含量如圖1 所示。

從圖1 知，黑曲霉固體發(fā)酵法輔助提取連翹黃酮得到的黃酮含量高于同種條件下輔助提取黃連黃酮得到的黃酮含量；枯草芽孢桿菌固體發(fā)酵法輔助提取連翹黃酮得到的黃酮含量高于同種條件下輔助提取黃連黃酮得到的黃酮含量；黑曲霉固體發(fā)酵法輔助提取黃連連翹混合草藥黃酮得到的黃酮含量高于枯草芽孢桿菌固體發(fā)酵法輔助提取黃連連翹混合草藥黃酮得到的黃酮含量；黑曲霉枯草芽孢桿菌混合菌固體發(fā)酵法輔助提取連翹黃酮得到的黃酮含量高于同種條件下輔助提取黃連黃酮得到的黃酮含量；黑曲霉枯草芽孢桿菌混合菌固體發(fā)酵法輔助提取連翹黃酮得到的黃酮含量低于同種條件下輔助提取黃連黃酮得到的黃酮含量；黑曲霉培養(yǎng)基不加菌條件下得到的黃連黃酮含量、枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基不加菌條件下得到的連翹黃酮含量均比加菌情況下得到的黃酮含量高，而剩余不加菌的培養(yǎng)方法得到的中草藥黃酮含量均低于其他條件相同但加菌條件下得到的中草藥黃酮含量。此方法也為其他中草藥中黃酮的提取提供了理論依據(jù)。

圖1 不同培養(yǎng)條件下黃酮含量的比較

2.2 不同菌種培養(yǎng)基下中草藥黃酮抗氧化活性的研究

2.2.1 黃酮對羥基自由基的清除作用。由圖2 可知，黃連、連翹在黑曲霉或枯草芽孢桿菌單一菌種固體培養(yǎng)基中得到的黃酮提取液對Fenton 體系產(chǎn)生的羥基自由基清除作用較強。對羥基自由基的清除能力∝黃酮提取液的濃度。所以黃連、連翹黃酮都對清除羥基自由基具有較好的效果，同時具有良好的抗氧化作用。

圖2 黃連、連翹黃酮對羥基自由基的清除作用

2.2.2 黃酮對DPPH 自由基的清除作用。由圖3 知，黃酮濃度在0.2-0.6g/L 時，在黑曲霉或枯草芽孢桿菌單一菌種的固體發(fā)酵培養(yǎng)環(huán)境中得到的黃酮提取液，DPPH 自由基的清除能力∝黃連、連翹黃酮提取液濃度，但黃酮濃度達(dá)到0.6g/L 之后，黃酮提取液對DPPH 自由基的清除能力趨于平緩。所以不同菌種發(fā)酵輔助提取的黃連、連翹黃酮都對DPPH 自由基有較強的清除作用。

圖3 黃連、連翹黃酮對DPPH 自由基的清除作用

2.2.3 鐵氰化鉀法進行黃酮還原能力的測定。由圖4 可知，在黑曲霉或枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)環(huán)境下的得到的黃酮提取液，黃連黃酮提取液在低黃酮濃度（0.15-0.25g/L）時，具有較高的還原能力，但隨著黃連黃酮濃度的增加，還原能力卻隨之減弱；連翹黃酮提取液在低黃酮濃度（0.15-0.25g/L）時，具有較低的還原能力，隨著連翹黃酮濃度的增加，還原能力也隨之增強。此實驗數(shù)據(jù)表明，黃連黃酮在低濃度下，還原能力較強；連翹黃酮濃度越高，還原能力越強。

圖4 黃連、連翹黃酮還原力的測定

2.2.4 黃酮亞鐵離子的螯合能力。由圖5 可知，亞鐵離子與啡啰嗪形成紫色絡(luò)合物，在波長562nm 下有最大吸光值，隨著黃連、連翹黃酮濃度的增加，亞鐵離子的螯合能力隨之提高。

圖5 黃連、連翹黃酮亞鐵離子氧化能力的測定

3 結(jié)論

該研究采用不同菌種的固體發(fā)酵法輔助提取黃連、連翹黃酮，黃酮的得率相比直接超聲提取黃銅的得率降低。通過對比發(fā)現(xiàn)，黑曲霉、枯草芽孢桿菌單一或混合固體發(fā)酵都導(dǎo)致黃連、連翹黃酮含量低于不發(fā)酵直接超聲提取的總黃酮含量。黑曲霉固體發(fā)酵法得黃連總黃酮含量達(dá)1.741mg/g、連翹總黃酮含量達(dá)4.836mg/g；枯草芽孢桿菌固體發(fā)酵法得到的黃連總黃酮含量達(dá)1.873mg/g、連翹總黃酮含量達(dá)2.031mg/g；黑曲霉的固體發(fā)酵法得到的黃連連翹混合草藥中總黃酮含量達(dá)6.578mg/g、枯草芽孢桿菌的固體發(fā)酵法得到的黃連連翹混合草藥中總黃酮含量達(dá)1.611mg/g；黑曲霉培養(yǎng)基中黑曲霉和枯草芽孢桿菌固體發(fā)酵法得黃連總黃酮含量達(dá)1.749mg/g、連翹總黃酮含量達(dá)2.928mg/g；枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基中黑曲霉和枯草芽孢桿菌混合菌固體發(fā)酵法得到的黃連總黃酮含量達(dá)4.196mg/g、連翹總黃酮含量達(dá)2.969mg/g。本實驗結(jié)果顯示，傳統(tǒng)方法超聲提取比微生物發(fā)酵方法提取黃酮更有優(yōu)勢，可能是因為黑曲霉、枯草芽孢桿菌代謝的豐富酶系對黃酮類物質(zhì)發(fā)生了轉(zhuǎn)變致使黃酮含量降低，具體生成何種物質(zhì)尚不明確[14]。黃連、連翹黃酮對清除羥基自由基具有較好的效果，對DPPH 自由基有一定的清除能力，對Fe2+的抗氧化能力良好，還原能力相對較差，表明黃連、連翹黃酮具有很好的抗氧化作用，這為黃連、連翹的開發(fā)提供了依據(jù)。關(guān)于黃連、連翹黃酮的結(jié)構(gòu)和微生物輔助提取還待深度研究。