毛天賜，張偉，羅娟

1.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院泌尿外科，陜西 西安 710038；2.西安市兒童醫(yī)院耳鼻喉科，陜西 西安 710038

當(dāng)膀胱細(xì)胞喪失控制時(shí)就會(huì)形成膀胱癌，該病為泌尿科常見的惡性腫瘤，具有較高的患病率，居惡性腫瘤第9 位[1]。早期多數(shù)患者常出現(xiàn)肉眼可見的血尿，隨著病情的不斷發(fā)展，還會(huì)出現(xiàn)尿急、尿頻、尿痛等臨床癥狀[2]。該病具有復(fù)發(fā)性高、致死率高及惡化程度較高等特點(diǎn)，造成該病患者死亡的主要因素為癌轉(zhuǎn)移，早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較多，依據(jù)腫瘤分級(jí)，進(jìn)行膀胱根治切除術(shù)后淋巴結(jié)陽(yáng)性率為5%～10%[3-4]。早期膀胱癌5 年內(nèi)的生存率約69%，患者一旦出現(xiàn)周圍淋巴結(jié)被入侵，5 年生存率隨之下降為35%，若發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，5 年內(nèi)生存率可下降至5%，因此早期診斷并予以及時(shí)的治療是改善患者預(yù)后的重點(diǎn)所在[5-6]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)為入侵外周血的細(xì)胞，同時(shí)也是腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的基本條件，因此檢測(cè)CTC 可為判斷患者是否出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、治療方案的選擇提供重要依據(jù)[7]。本文分析了不同腫瘤分期(TNM)膀胱癌患者外周血CTCs 的表達(dá)情況，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院2018 年6 月至2020 年9 月接收的58 例膀胱癌患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者自主同意參與本研究；(2)患者均符合膀胱癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；(3)抽血檢查前未接受化療、放療等治療措施；(4)依從性良好者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床資料缺失或不全者；(2)合并其他惡性腫瘤者；(3)肝腎功能障礙者；(4)尿路感染者。58 例中男性35 例，女性23 例；年齡43～72 歲，平均(63.54±4.67)歲，其中≤63 歲27 例，＞63 歲31 例。依據(jù)國(guó)際TNM 分期系統(tǒng)將患者進(jìn)行劃分，T 分期：T1期13 例，T2期16 例，T3期19 例，T4期10 例；N 分期：N0期26 例，N1期17 例，N2期8 例，N3期7 例；M 分期：M0期48 例，M1期10 例；TNM 總分期包括Ⅰ期10 例，Ⅱ期16 例，Ⅲ期18 例，Ⅳ期14 例；分化程度較低者35 例，分化程度較高者23 例；出現(xiàn)脈管侵犯者41 例，未出現(xiàn)脈管侵犯者17 例；出現(xiàn)神經(jīng)侵犯者38 例，未出現(xiàn)神經(jīng)侵犯者20 例；腫瘤大小≤6 cm3者34 例，腫瘤大小＞6 cm3者24例。

1.2 方法

1.2.1 CTCs采集方法 采集患者外周血5～8 mL，棄去前2 mL血液(前2 mL血液可能混合上皮細(xì)胞，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性)，收集于ACD抗凝管內(nèi)，將其上下輕微顛倒以混勻血液，血液標(biāo)本的保存及運(yùn)輸均置于0℃～4℃環(huán)境中。

1.2.2 血液樣品CTCs的染色及分離 (1)選用密度梯度離心法進(jìn)行樣本處理。采用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)依照1∶1 的比例進(jìn)行全血稀釋，將稀釋所得血液樣本緩慢置入含有20 mL 聚蔗糖(Ficoll)單核層細(xì)胞分離液的離心管中(刻度為50 mL)進(jìn)行離心，時(shí)間約15 min。離心處理后棄去上層血漿，將所留樣品置入新離心管(刻度為50 mL)中，向離心管內(nèi)添加PBS約20 mL，輕微搖晃混勻，4℃環(huán)境中進(jìn)行離心，時(shí)間為10 min，離心后棄去上清液。(2)捕獲抗體(EpCAM)的孵育。將200 μL的PBS重懸細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中(刻度為1.5 mL)。添加1份EpCAM，在正常室溫環(huán)境中進(jìn)行孵育，時(shí)間為1 h。孵育后再次加入800 μL的PBS進(jìn)行混勻，離心5 min，棄去上清液，應(yīng)用200 μL 的PBS 重懸細(xì)胞。(3)腫瘤細(xì)胞的分離。將孵育得到的細(xì)胞懸液置入芯片中予以細(xì)胞分離，流速以200 μL/h 為宜，時(shí)間為1 h，分離后拆開芯片，并將芯片放置于器皿內(nèi)。(4)CTCs 的染色方法。在芯片表面鋪滿固定劑，并進(jìn)行15 min 的處理后除去固定劑。加透膜劑，予以處理，時(shí)間為15 min。加一抗混合液，在4℃避光環(huán)境中進(jìn)行過(guò)夜孵育。次日應(yīng)用PBS 進(jìn)行泡洗，在15 min內(nèi)、7～8 mL 的PBS 里進(jìn)行3 次。再加二抗混合液，室溫條件下進(jìn)行避光孵育，約40 min，加染核試劑，時(shí)間為20 min。再次應(yīng)用PBS 進(jìn)行泡洗，方法與上述一致。觀察并計(jì)算CTC陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。見圖1和圖2。

圖1 可疑腫瘤細(xì)胞(×200)

圖2 上皮來(lái)源細(xì)胞(×200)

1.3 觀察指標(biāo) (1)比較不同臨床病理特征(包括性別、病理類型、年齡、分化程度、腫瘤大小、TNM總分期、T分期、N分期、M分期、脈管侵犯及神經(jīng)侵犯等)患者之間CTCs 陽(yáng)性率的差異。(2)比較不同TNM 分期患者的CTCs計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用方差分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床病理特征患者的CTCs 陽(yáng)性率比較 58 例患者中CTCs 陽(yáng)性者共22 例。膀胱癌患者不同性別、病理類型、年齡、分化程度及腫瘤大小間的CTCs 陽(yáng)性率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；TNM 總分期(Ⅲ期+Ⅳ期)、T3+T4、N1+N2+N3、M1、脈管侵犯及神經(jīng)侵犯患者中的CTCs 陽(yáng)性率明顯高于Ⅰ期+Ⅱ期、T1+T2、N0、M0及無(wú)脈管侵犯和神經(jīng)侵犯者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 不同臨床病理特征患者的CTCs陽(yáng)性率比較[例(%)]

2.2 不同TNM分期患者CTCs計(jì)數(shù)比較 CTCs計(jì)數(shù)在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者中依次升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 不同TNM分期患者的CTCs計(jì)數(shù)比較(，個(gè))

表2 不同TNM分期患者的CTCs計(jì)數(shù)比較(，個(gè))

注：與Ⅰ期比較，aP＜0.05；與Ⅱ期比較，bP＜0.05；與Ⅲ期比較，cP＜0.05。

3 討論

膀胱癌為泌尿系三大惡性腫瘤之一，發(fā)病率及致死率均居泌尿系惡性腫瘤前列，該病患病率存在種族性、地域性、性別差異，可于任何年齡患病，好發(fā)于50～70 歲人群[9-10]。相關(guān)調(diào)查結(jié)果顯示，2018 年世界范圍內(nèi)膀胱癌患者約為54.9 萬(wàn)人，死亡人數(shù)約20 萬(wàn)人[11]。多數(shù)患者通常表現(xiàn)為肉眼無(wú)痛性血尿，隨著腫瘤的持續(xù)性生長(zhǎng)及不斷浸潤(rùn)，可導(dǎo)致間斷性血尿發(fā)展為持續(xù)惡性血尿，患者于晚期可發(fā)生排尿不暢等情況，甚至出現(xiàn)上尿路梗阻及尿潴留情況[12]。該病發(fā)病因素較復(fù)雜，臨床難以確定具體的患病病因，其中基因因素與環(huán)境因素具有較為密切的聯(lián)系，基因因素包括癌基因激活因素，環(huán)境因素主要包括吸煙、慢性長(zhǎng)期性炎癥、高危型化學(xué)物品等[13]。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，發(fā)現(xiàn)膀胱癌與其他因素也存在密切的關(guān)系。

國(guó)內(nèi)外對(duì)于外周血CTCs 在惡性腫瘤(如前列腺癌、乳腺癌、肺癌等)中的研究及報(bào)道較多，目前有多項(xiàng)研究表明，腫瘤TNM分期情況CTCs之間有一定的相關(guān)性，有利于制定個(gè)性化治療方案及后期療效觀察，現(xiàn)普遍認(rèn)為該病發(fā)生的前提之一為CTCs。孫建兵等[14]提出過(guò)關(guān)于腎癌的研究，該研究將99 例腎癌患者，依據(jù)性別、病灶部分、浸潤(rùn)深度、年齡、分化程度、TNM分期及脈管癌栓進(jìn)行劃分，探討與CTCs 之間的關(guān)系。有研究表明，TNM 分期與CTCs 之間具有較高的相關(guān)性。檢測(cè)膀胱癌患者外周血CTCs水平能有效判定患者血行轉(zhuǎn)移情況以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況[15]，對(duì)患者預(yù)后及療效評(píng)定具有重大意義。CTCs為現(xiàn)階段膀胱癌特異性血清標(biāo)志物，因惡性腫瘤細(xì)胞可入侵至周圍組織中，進(jìn)入淋巴管及血液系統(tǒng)中，并轉(zhuǎn)運(yùn)至遠(yuǎn)端組織中，形成病灶，CTCs能反映出轉(zhuǎn)移的實(shí)時(shí)情況[16-17]。研究表明，Ⅲ期或Ⅳ期膀胱癌進(jìn)行CTCs 檢測(cè)具有更大的臨床價(jià)值[18]。本研究對(duì)我院接收的58 例膀胱癌患者依據(jù)TNM 分期、年齡、病理類型(導(dǎo)管浸潤(rùn)型、小葉浸潤(rùn)型)、分化程度、脈管侵犯、神經(jīng)侵犯、性別進(jìn)行劃分，結(jié)果顯示膀胱癌患者不同性別、病理類型、年齡、分化程度及腫瘤大小間，CTCs 陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；患者TNM 總分期(Ⅲ期+Ⅳ期)、T3+T4、N1+N2+N3、M1、脈管侵犯及神經(jīng)侵犯患者中CTCs陽(yáng)性率明顯高于Ⅰ期+Ⅱ期、T1+T2、N0、M0及無(wú)脈管侵犯和神經(jīng)侵犯者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。這與葛海燕等[19]提出的研究結(jié)論具有同質(zhì)性，本研究與其對(duì)比具有一定的優(yōu)勢(shì)，因本研究增加了TNM 總分期患者檢測(cè)CTCs 計(jì)數(shù)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)CTCs 計(jì)數(shù)隨著TNM 分期的升高而增加。

綜上所述，膀胱癌患者CTCs 表達(dá)與腫瘤分期存在密切的關(guān)系，腫瘤TNM 分期越高，CTCs 計(jì)數(shù)越高，表明CTCs 可作為膀胱癌患者臨床診斷的重要指標(biāo)之一。