向家培，雷玉華

恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北 恩施 445000

心臟纖維化是多種心血管疾病的共同病理特征，包括高血壓、心肌梗死、擴張性心肌病和糖尿病心肌病[1]，細胞外基質(zhì)和膠原蛋白的大量產(chǎn)生和沉積是心肌纖維化的主要病理特征[2]。目前，許多研究都已經(jīng)證實了轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)/Smad信號通路在心肌纖維化發(fā)生發(fā)展中的重要地位[3]。細胞外的TGF-β可通過活化心臟成纖維細胞上的Ⅰ型和Ⅱ型TGF-β受體進而磷酸化胞漿內(nèi)的Smad2和Smad3。一旦Smad2 和Smad3 被磷酸化，兩者將與Smad4 形成復合體進入細胞核，誘導促纖維化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活[4]。因此，阻斷TGF-β/Smad信號的活化是預防和治療心肌纖維化的主要策略之一。

組蛋白去乙酰化酶3(histone deacetylase 3，HDAC3)是組蛋白去乙?；讣易宓闹匾蓡T之一，可通過催化組蛋白去乙酰化，影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性并調(diào)控基因表達[5-6]。在腎臟纖維化時，腎小管上皮細胞中的HDAC3蛋白表達水平明顯升高，而敲低HDAC3可明顯抑制腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)分化，進而抑制腎臟纖維化的進展[7]，但HDAC3在心肌纖維化中的作用目前尚未被報道。本研究通過構(gòu)建異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)誘導小鼠心肌纖維化模型,觀察HDAC3 在小鼠心肌組織中的表達狀況，并使用HDAC3特異性抑制劑RGFP966干預，探討HDAC3影響心肌纖維化的作用及機制，旨在為今后心肌纖維化的預防及治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 RGFP966 (純度：99.81%，批號：HY-13909)和ISO(純度：98.61%，批號：HY-B0468)均購自于上海MedChemExpress 公司；一抗：GAPDH(批號：ab8245)、Klotho(批號：ab181373)、P-Smad3(批號：ab52903)、T-Smad3 (批號：ab208182)、α-SMA(批號：ab5831)、HDAC3 (批號：ab32369)購自于美國Abcam 公司；二抗：羊抗兔IgG(批號：926-32211)購自于美國LICOR 公司。

1.2 實驗動物及心肌纖維化模型的建立 本實驗中所使用的動物為雄性C57BL/6J小鼠，購自于湖北省實驗動物研究中心。小鼠周齡10～12 周，體質(zhì)量236～311 g。根據(jù)隨機數(shù)表法將40只小鼠隨機分為對照組(Sham 組)、RGFP966 組、ISO 組、ISO+RGFP966組,每組10只。ISO組和ISO+RGFP966組小鼠接受皮下注射ISO (1 mg/kg，bid)，連續(xù)14 d。RGFP966 及ISO+RGFP966組小鼠于ISO注射當天開始，每天下午接受皮下注射RGFP966(10 mg/kg，qd)，連續(xù)14 d。本實驗所有操作獲恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院實驗動物護理和使用委員會批準。

1.3 小鼠心臟功能的評價 采用MyLab 30CV多普勒超聲診斷儀器對四組小鼠進行無創(chuàng)心功能檢測。使用濃度為1.5%的異氟烷對小鼠進行吸入麻醉。待小鼠麻醉成功后，剃去小鼠心前區(qū)毛發(fā)，充分暴露小鼠皮膚。超聲探頭頻率為30 MHz，分別記錄穿過左心室前壁和后壁的M型超聲，獲取小鼠心臟功能參數(shù)，包括射血分數(shù)、短軸縮短率(F、左室收縮末期內(nèi)徑和左室舒張末期內(nèi)徑。

1.4 蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot) 待測完各組小鼠心臟功能后采用頸椎脫臼法處死小鼠，分離出小鼠心臟，拭去心臟表面血液后，置于-80℃冰箱中保存。待進行Westen blot檢測相關(guān)蛋白時，剪取各組小鼠心室肌組織約30 mg，充分研磨后在RIPA裂解緩沖液中進行超聲裂解。提取各組小鼠心肌組織中的總蛋白。檢測各樣本蛋白濃度后使用上樣緩沖液定容至等濃度，隨后分裝并置于-80℃冰箱長期保存。分別配制10%的分離膠和6%的濃度膠，對各組小鼠心肌蛋白進行SDS-PAGE電泳。待電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)入醋酸纖維素膜中，并在4℃下使用牛奶封閉40 min。隨后，分別用抗HDAC3、Klotho、P-Smad3、T-Smad3、α-SMA 和GAPDH 的一抗于4℃下孵育過夜，隨后于二抗稀釋液中避光孵育，置于搖床上1 h。使用化學發(fā)光法對目的條帶顯影并定量。

1.5 實時熒光定量PCR 將-80℃冰箱中的心肌組織取出，使用TRIzol試劑盒提取各組小鼠心肌組織總RNA，紫外分光計測定純度和濃度后對各樣本總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，獲取cDNA。隨后，使用ChamQTMSYBR qPCR Master Mix試劑盒對各樣本cDNA進行實時熒光定量PCR檢測，以β-actin作為內(nèi)參，用2-△△Ct法計算基因的相對表達水平。各基因引物由Primer premier 5軟件設(shè)計，引物序列如表1所示。

表1 各基因引物序列

1.6 免疫組織化學染色 將心肌組織石蠟切片經(jīng)過脫蠟水洗、抗原修復、羊血清封閉、HDAC3 抗體孵育、二抗孵育、DAB顯色、脫水、透明及封片等一系列免疫組織化學染色步驟后，在光學顯微鏡下觀察心肌組織中HDAC3表達狀并拍照記錄。使用Image Pro Plus 6.0軟件對心肌組織中HDAC3陽性區(qū)域進行定量。

1.7 馬松染色 將心肌組織石蠟切片經(jīng)過脫蠟水洗后，使用蘇木素染液浸染5 min，中性鹽酸酒精溶液分化5 s，自來水流水沖洗10 min。隨后，使用麗春紅酸性品紅溶液染色4 min，迅速用蒸餾水漂洗3 次。使用磷鉬酸水溶液孵育3 min，苯胺藍染色5 min，1%冰醋酸孵育1 min。蒸餾水漂洗后，脫水、透明及封片并在光學顯微鏡下觀察拍照。使用Image Pro Plus 6.0軟件對心肌組織中膠原纖維進行定量。

1.8 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS26.0 軟件分析實驗數(shù)據(jù)，計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差(x-±s)表示，組間兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌纖維化組織中HDAC3 蛋白的表達狀況 免疫印跡Western blot結(jié)果(圖1A)顯示，ISO組小鼠心肌組織中HDAC3 蛋白相對表達量為3.12±0.18，較Sham 組的1.03±0.14 明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；免疫組織化學染色(圖1B)進一步證實，ISO組小鼠心肌組織中HDAC3陽性細胞百分比明顯高于Sham組[(41.32±2.56)%vs(9.33±1.45)%]，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖1 心肌纖維化小鼠心臟組織中HDAC3的蛋白表達狀況(×200)

2.2 各組小鼠心臟功能比較 與Sham 組相比，ISO 組小鼠射血分數(shù)和短軸縮短率明顯降低，左室舒張末期內(nèi)徑和左室收縮末期內(nèi)徑明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；與ISO組小鼠相比，ISO+RGFP966組小鼠射血分數(shù)和短軸縮短率明顯增加，左室舒張末期內(nèi)徑和左室收縮末期內(nèi)徑明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 各組小鼠心功能比較()

表2 各組小鼠心功能比較()

注：與Sham組比較，aP＜0.05；與ISO組比較，bP＜0.05。

2.3 各組小鼠心肌纖維化比較 馬松染色結(jié)果顯示,與Sham 組相比，ISO 組小鼠心肌組織中膠原沉積明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；相反，經(jīng)RGFP966 干預后，心肌纖維化小鼠心肌組織中膠原沉積明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖2 和表3。實時熒光定量PCR 進一步顯示，RGFP966 干預可明顯抑制ISO 導致的心肌組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和CTGF 的mRNA 表達增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表3。

表3 各組小鼠心肌組織中膠原沉積及纖維化標志分子的mRNA相對表達水平比較()

表3 各組小鼠心肌組織中膠原沉積及纖維化標志分子的mRNA相對表達水平比較()

注：與Sham組比較，aP＜0.05；與ISO組比較，bP＜0.05。

圖2 各組小鼠心肌纖維化馬松染色結(jié)果(×200)

2.4 RGFP966減輕小鼠心肌纖維化的機制 與Sham 組相比，ISO 組小鼠心肌組織中Klotho 蛋白明顯降低，磷酸化的Smad3 (P-Smad3)及α-SMA 的蛋白明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；相反，RGFP966 干預可明顯上調(diào)心肌纖維化小鼠心肌組織中Klotho 的蛋白水平，下調(diào)P-Smad3 及α-SMA 的蛋白水平，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖3 和表4。

圖3 各組小鼠心肌纖維化組織相對蛋白表達比較

表4 各組小鼠心肌組織中不同蛋白指標的相對含量比較()

表4 各組小鼠心肌組織中不同蛋白指標的相對含量比較()

注：與Sham組比較，aP＜0.05；與ISO組比較，bP＜0.05。

3 討論

本研究首次揭示在ISO 誘導的小鼠心肌纖維化中，心肌組織中HDAC3的蛋白表達明顯升高。同時，本研究觀察到HDAC3特異性抑制劑RGFP966具有抑制ISO 相關(guān)心肌纖維化的作用，并進一步探討了RGFP966抗心肌纖維化的可能機制。既往研究顯示，在心肌發(fā)生纖維化期間，心臟成纖維細胞可產(chǎn)生大量的膠原纖維，沉積于心肌細胞外基質(zhì)[8]。此外，心臟成纖維細胞在某些促纖維化因素(如ISO，TGF-β及高糖)的刺激下，也可轉(zhuǎn)分化為高表達α-SMA的肌成纖維細胞，這也是導致細胞外基質(zhì)沉積的重要原因之一[9-10]。TGF-β是目前研究最為深入的促纖維化因子，其存在有3 種不同的亞型，分別為TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3。TGF-β可通多種機制誘導心肌纖維化。除了增加胞外基質(zhì)的沉積并抑制其降解，TGF-β還參與了多種促纖維化細胞因子的表達[11]。

目前，已經(jīng)公認的心肌纖維化模型主要包括以下6種：(1)自發(fā)性高血壓大鼠；(2)糖尿病心肌病；(3)胸主動脈縮窄；(4)心肌梗死；(5)二腎一夾及腎下主動脈縮窄；(6)ISO 皮下注射[12]。動物模型的高仿性，穩(wěn)定性和易操作性是心血管疾病研究的首要考慮因素。相比于前5種模型，ISO模型的建立動物死亡率低，操作方法更為簡便，造模周期也相對較短，且更加接近于疾病進程。機制上，ISO 刺激可導致小鼠心肌組織中TGF-β的表達增加，促進心肌纖維化的發(fā)生[13-14]。因此，本研究選擇了ISO誘導的小鼠心肌纖維化模型，觀察到HDAC3 蛋白在ISO 皮下注射14 d 后表達水平明顯增加，這就提示HDAC3 可能參與了小鼠心肌纖維化發(fā)生發(fā)展的進程。

在哺乳動物中，組蛋白的乙?；艿浇M蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferases，HATs)和HDACs 的動態(tài)調(diào)控。一般而言，HDACs通過去乙酰化賴氨酸殘基和恢復染色質(zhì)組蛋白的正電荷導致染色質(zhì)凝聚，阻礙轉(zhuǎn)錄因子的進入，最終抑制相關(guān)基因表達[15]。在腎臟纖維化形成過程中，HDACs的上調(diào)可影響促纖維化生長因子、細胞信號分子、細胞外基質(zhì)蛋白和腎臟抗纖維化蛋白的表達。例如，HDACs抑制劑可明顯上調(diào)抗纖維化蛋白Klotho 及BMP-7 的水平，最終抑制腎臟纖維化的進展[16]。最近的一項研究表明，腎小管上皮細胞HDAC3特異性敲除或使用HDAC3特異性抑制劑RGFP966均可減輕輸尿管結(jié)扎引起的腎臟纖維化，其機制可能與HDAC3對抗纖維化蛋白Klotho的抑制有關(guān)[7]。與該研究一致，本研究首次揭示RGFP966 可明顯上調(diào)心肌纖維化小鼠心臟組織中Klotho 的蛋白表達，同時減輕小鼠心肌纖維化。筆者推測，RGFP966可能通過Klotho介導的TGF-β/Smad信號通路阻斷發(fā)揮抗纖維化作用。但本研究仍舊存在一定的局限性。首先，本研究只在在體水平探討了HDAC3 抑制對小鼠心肌纖維化中的作用，沒有離體實驗數(shù)據(jù)進一步驗證；其次，盡管本研究使用的RGFP966是HDAC3特異性抑制劑，但RGFP966 對HDAC3 活性抑制效率和特異性均有限，因此后續(xù)需要進一步構(gòu)建HDAC3基因敲除小鼠進一步驗證HDAC3在心肌纖維化中的作用；再者，HDAC3 如何抑制Klotho 表達也需要更深入的研究進行探討。

總之，本研究首次證實了HDAC3抑制可改善ISO誘導的小鼠心肌纖維化。HDAC3 可能通過抑制心肌組織抗纖維化蛋白Klotho，進而放大TGF-β/Smad 信號,最終導致小鼠心肌纖維化的發(fā)生。但仍需要更深入的實驗進一步探討HDAC3調(diào)控Klotho的精確的分子靶點。