鄧麗明，周桂芳，梁博萱，梁智萍，賴麗麗，黃蕾蕾

1.廣東省職業(yè)病防治院，廣東 廣州 510260；2.南方醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510515；3.南方醫(yī)科大學，廣東 廣州 510515

矽肺是長期吸入大量游離的二氧化硅粉塵引發(fā)的肺部組織彌漫性纖維化全身性疾病，其可通過誘導肺泡巨噬細胞促進肺部炎癥、細胞凋亡而促進肺組織纖維化，從而引發(fā)氣體交換功能障礙以及肺功能不可逆性喪失[1-3]。矽肺發(fā)病機制復雜，PI3K/Akt信號通路激活已被證實在其中具有促進作用[4]。miR-489 與多種癌癥細胞增殖相關，亦有研究表明其可能影響矽肺誘導的纖維化[5-6]。由此可見，miR-489可能通過調(diào)控肺纖維化相關信號通路如PI3K/Akt 信號通路而影響矽肺誘導的肺纖維化進程，但目前相關研究仍較少。因此，本研究通過建立矽肺小鼠動物模型，分析miR-489 促進矽肺誘導小鼠肺纖維化的作用及其與調(diào)控PI3K/Akt 信號通路的關系，旨在為明確矽肺發(fā)病機制以及矽肺的防治提供分子學依據(jù)，現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 樣本、儀器和試劑 SPF 級C57BL/6 雄性小鼠80 只，周齡4～5 周，均由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供[許可證號：SCXK (渝) 2017-0015]。SPF 級C57BL/6 雄性小鼠80 只隨機分為空白組、模型組、miR-489 組和對照組，每組小鼠20 只。各組小鼠均獨立飼養(yǎng)，溫度控制在22℃～24℃，濕度75%，明暗周期12 am/12 pm，采用標準飼料(北京中興飼料公司)和純凈水(杭州娃哈哈集團)，小鼠均自由飲水和攝食，適應性飼養(yǎng)一周后進行相關實驗研究。采用的儀器和試劑如下：SiO2粉塵(美國Sigma 公司)，miRNA 對照和miR-489 agomir(廣州銳博生物)，HE 試劑盒和免疫組化試劑盒(英國Abcam 公司)，miR-489、PI3K、Akt 引物(上海生工)，RNA 提取試劑盒(德國Qiagen)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega)，SYBR Premix EXTaq和PCR試劑盒(日本TaKaRa)，Centrifuge 5920R離心機、微量移液器和RM2125 切片機(德國艾本德)，7900HT實時熒光定量PCR儀(美國ABI)，BM-V1 生物組織冷凍包埋機和TS-12F 生物組織自動脫水機(孝感市電子儀器廠)，過氧化氫和辣根過氧化物酶(北京博奧森生物)，二甲苯、4%多聚甲醛和酒精(上?；瘜W試劑)，微波爐(中國美的)，低溫冰箱(中國海爾)，ANTI-MOUL 光學顯微鏡(日本Nikon)，電泳儀(北京六一)，SPOT INSIGHT GOLO 照相系統(tǒng)(日本Olympus)。

1.2 實驗方法

1.2.1 染塵操作 SiO2粉塵50 g精細研磨后進行高壓滅菌，加入1 mL 的0.9%的氯化鈉溶液中充分混勻制作SiO2粉塵懸液。模型組、miR-489 組和對照組均通過微量注射器經(jīng)氣管一次灌注50 mg/kg SiO2濃度的SiO2粉塵懸液，進行染塵操作從而建立矽肺小鼠模型，空白組不進行氣管灌注染塵操作。染塵操作后四組均予以相同飼養(yǎng)條件和環(huán)境，飼養(yǎng)條件同1.1。

1.2.2 尾靜脈注射 染塵操作30 d、45 d 后，miR-489 組給予3 nmol 的miR-489 agomir 尾靜脈注射，模型組給予3 nmol的對照miRNA尾靜脈注射，對照組同期尾靜脈注射等量生理鹽水，空白組不進行尾靜脈注射操作。尾靜脈注射操作后四組均予以相同飼養(yǎng)條件和環(huán)境，飼養(yǎng)條件同1.1。

1.2.3 免疫組化檢測 染塵操作60 d后，均收集四組小鼠右下肺組織，進行免疫組化檢測PI3K、Akt蛋白表達。將獲取的肺組織常規(guī)進行福爾馬林固定以及石蠟包埋并切制成厚度為0.4 μm的連續(xù)切片。二甲苯脫蠟后梯度酒精脫水去除二甲苯，內(nèi)源性過氧化物酶滅活，抗原熱修復，添加一抗40μL，20℃孵育60 min，添加二抗40μL，20℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染并進行返藍、脫水、透明、吹干，進行中性樹膠封片觀察。顯微鏡下隨機觀察5個視野(200×)，PI3K蛋白、Akt蛋白均表達定位于細胞質(zhì)和/或細胞核，細胞出現(xiàn)棕黃色、棕褐色、黃色顆粒為陽性染色，陽性染色細胞＜10%為陰性表達，陽性染色細胞≥10%時為陽性表達，統(tǒng)計四組小鼠肺組織的PI3K蛋白、Akt蛋白陽性表達率。

1.2.4 RT-PCR 檢測 染塵操作60 d 后，均收集四組小鼠右上肺組織，常規(guī)進行研磨制成勻漿，常規(guī)行總RNA提取以及逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA。采用RT-PCR法，以GAPDH 為內(nèi)參基因和以2-ΔΔCt法檢測比較四組PI3K、Akt的相對定量，以內(nèi)標為snRNAde U6 RNA 和以2-ΔΔCt法進行miR-489 相對定量。各引物序列情況如下：U6 上游引物序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；下游引物序列：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。GAPDH上游引物序列：5'-CCCATGGCAAATTCCATGGCACC-3'；下游引物序列PI3K 上游引物序列：5'-ATTTCTTCCTAACTGCAGCG-3'；下游引物序列：5'-ATGGCAGCAGGCTTATACAGATAAGAC-3'。Akt上游引物序列：5'-TCAGTAGCATCCGGCAATATC-3'；下游引物序列：5'-TGCTGCAATCAAAGCCACAGTC-3'。miR-489上游引物序列：5'-GTATCCAGTGCGGTCCGAGGTATTCGCACTG-3'；下游引物序列：5'-TGCAGGGTCCGAGGTCAGACTGA-3'。PCR 反應體系組成如下：TaqMan MicroRNA Assay(20×)、正義鏈引物和反義鏈引物各1 μL，逆轉(zhuǎn)錄反應產(chǎn)物1.33 μL，TaqMan 2×Universal PCR Master Mix Ⅱ10 μL，然后加DEPC水至20 μL。PCR反應條件如下：95℃預變性1 min、95℃變性0.5 min、60℃退火40 s、72℃延伸15 s，共進行40 個循環(huán)，72℃延伸10 min，將獲得的PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂凝膠電泳，電腦分析CT值，根據(jù)相對定量分析方法，計算2-ΔΔCt為樣本miR-489、PI3K、Akt的RNA相對含量值。

1.2.5 纖維化評分 染塵操作60 d 后，均收集四組小鼠左下肺組織，以4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋并切制成厚度為0.4 μm的連續(xù)切片，常規(guī)行蘇木精-伊紅(HE)染色并在顯微鏡下(200×)進行四組肺組織病理學觀察，并評價比較四組纖維化評分，纖維化評分[6]：分值0～5分，分值越高提示纖維化越嚴重，其中嚴重程度評判標準情況為0分為觀察結(jié)果無異常，1分為邊緣異常，2分為輕微異常，3分為重度異常，4分為嚴重異常，5分為異常非常嚴重；損傷情況評價為0分為沒有發(fā)現(xiàn)損傷，1 分為發(fā)現(xiàn)少量或集會下出現(xiàn)的損傷且損傷占肺部面積≤10%，2 分為稀少和有限的損傷且損傷占肺部面積11%～25%，3 分為中度損傷且損傷占肺部面積26%～50%，4分為擴增性或廣泛分布的損傷且損傷占肺部面積51%～75%，5分為非常廣泛和明顯的損傷且損傷占肺部面積＞75%。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用IBM SPSS Statistics 21.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析；計數(shù)資料以百分率表示且采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法進行比較；計量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差(x-±s)表示，多組計量資料比較采用方差分析并通過SNK-q檢驗進行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 四組小鼠肺組織PI3K、Akt 蛋白表達量比較 四組小鼠肺組織PI3K、Akt蛋白表達比較，空白組最低，其次為miR-489組，再次為模型組和對照組，空白組肺組織PI3K、Akt蛋白表達低于其他三組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；而miR-489組、模型組和對照組肺組織PI3K、Akt 蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1和圖1。

圖1 四組小鼠肺組織PI3K、Akt蛋白表達免疫組化染色結(jié)果(免疫組化SP，200×)

表1 四組小鼠肺組織PI3K、Akt蛋白表達量比較[例(%)]

2.2 四組小鼠肺組織miR-489、PI3K、Akt mRNA相對表達量比較 四組小鼠肺組織PI3K、Akt mRNA相對表達量比較，空白組最低，其次為miR-489組，再次為模型組和對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；而模型組和對照組肺組織PI3K、Akt mRNA 相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。miR-489 組miR-489 的mRNA 相對表達量高于空白組、模型組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；空白組、模型組和對照組miR-489 的mRNA 相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 四組小鼠肺組織miR-489、PI3K、Akt mRNA相對表達量比較()

表2 四組小鼠肺組織miR-489、PI3K、Akt mRNA相對表達量比較()

注：與空白組比較，aP＜0.05；與miR-489組比較，bP＜0.05。

2.3 四組小鼠肺組織病理學變化 四組小鼠肺組織纖維化評分比較，空白組最低，其次為miR-489組，再次為模型組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；而模型組和對照組纖維化評分比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表3。HE 染色結(jié)果顯示，空白組的清晰可見肺組織肺泡結(jié)構，肺泡壁纖薄完整且無擴張或充血水腫，支氣管完好無明顯異常，肺泡內(nèi)無明顯滲出，肺泡間質(zhì)無炎癥細胞浸潤或增生纖維組織；模型組和對照組均出現(xiàn)肺泡間隔增厚以及數(shù)量眾多且大小不一的矽結(jié)節(jié)，其內(nèi)可見塵細胞、炎細胞和成纖維細胞，miR-489 組出現(xiàn)少量且先相對較小的矽結(jié)節(jié)，其內(nèi)含有少量的塵細胞、炎細胞和成纖維細胞，見圖2。

表3 四組小鼠肺組織纖維化評分比價比較()

表3 四組小鼠肺組織纖維化評分比價比較()

注：與空白組比較，aP＜0.05；與miR-489組比較，bP＜0.05。

3 討論

3.1 矽肺肺纖維化情況及其危害 肺纖維化疾病常見，其成纖維細胞出現(xiàn)大量異常增殖、轉(zhuǎn)化、分泌和沉積大量細胞外基質(zhì)，肺泡上皮炎性損傷，損傷區(qū)域和間質(zhì)中成纖維細胞轉(zhuǎn)化，成纖維細胞出現(xiàn)增殖、活化以及遷移，從而導致肺間質(zhì)病理改變，為慢性進行性纖維化性間質(zhì)性肺炎，其病變局限于肺部，多發(fā)生于中老年男性人群[7-8]。肺纖維化可由多種因素導致，其中矽肺可通過二氧化硅粉塵引發(fā)肺組織彌漫性纖維化[9-10]。肺纖維化病程呈現(xiàn)進行性發(fā)展，可明顯影響肺的氣體交換，嚴重影響呼吸功能，嚴重者可因發(fā)展為呼吸功能喪失和呼吸衰竭而死亡，多數(shù)患者在確診后2～5 年期間死亡，預后情況極差[11-13]。因此，明確矽肺等因素導致的肺纖維化發(fā)病機制，對肺纖維化進行有效防治十分必要。

3.2 PI3K/Akt 信號通路與矽肺肺纖維化的關系 肺纖維化的發(fā)病機制復雜，涉及多個病理生理過程及相關基因以及信號通路[14]。PI3K/Akt信號通路已被證實與肺纖維化密切相關[15-16]。PI3K 為信號傳導酶，可被酪氨酸激酶受體、G 蛋白偶聯(lián)受體、G 蛋白細胞因子受體、RAS蛋白相關GDP酶受體等激活從而發(fā)揮促進細胞增殖、黏附、分化等，可分為四種特異性底物，其中Ⅰ型PI3K參與Akt的激活其亞基之一與肺纖維化密切相關；而Akt是PI3K下游中的絲氨酸/蘇氨酸激酶，有3 種異構體，可參與細胞增殖和分化，可通過激活mTOR、缺氧誘導因子1α等參與肺纖維化；此外，PI3K/Akt信號通路參與肺纖維化可能與其上游中的結(jié)締組織生長因子激活、VEGF、ROS 等相關，且可能協(xié)同MAPK 信號通路共同影響肺纖維化發(fā)生發(fā)展[17]。本研究通過氣管一次灌注SiO2粉塵懸液建立矽肺小鼠模型，其中肺纖維化明顯小鼠的PI3K、Akt 蛋白和mRNA 表達水平均出現(xiàn)不同程度的升高，且隨著肺纖維化程度的加重而升高，進一步證實了PI3K/Akt信號通路參與肺纖維化發(fā)生發(fā)展。而于小林[18]的研究中發(fā)現(xiàn)下調(diào)PI3K/AKT 信號通路的轉(zhuǎn)錄和表達有助于改善肺纖維化模型大鼠肺組織的病理惡化情況且有助于肺組織順應性和呼吸功能的改善，亦證實了PI3K/AKT 信號通路參與肺纖維化，與本研究結(jié)論一致，而其調(diào)節(jié)干預為肺纖維化治療的有效途徑之一。

3.3 miR-489 與矽肺肺纖維化的關系 非編碼單鏈小分子RNA 參與細胞的發(fā)育、分化、增殖、凋亡、遷移等多種細胞生物學行為調(diào)控，miR-489 是非編碼單鏈小分子RNA的一種，在腫瘤細胞增殖等過程中具有催化作用，可通過調(diào)控多種信號轉(zhuǎn)導通路而影響細胞的生長、分化、遷移、黏附、凋亡等過程[19-21]。且有研究證實，miR-489 可通過調(diào)控PI3K/Akt 信號通路而影響癌癥發(fā)生發(fā)展[22-23]。因此miR-489 可能通過調(diào)控PI3K/Akt 信號通路而影響其肺成纖維細胞的增殖、轉(zhuǎn)化等而影響肺纖維化病情，但其具體作用和機制尚不明確，有待研究證實。因此，本研究檢測了矽肺誘導肺纖維化模型小鼠的miR-489表達情況，結(jié)果顯示其在小鼠正常肺組織中具有一定的表達，而通過miR-489 agomir 提高miR-489 表達的同時，小鼠的肺泡間隔增厚以及出現(xiàn)增加的矽結(jié)節(jié)，其矽結(jié)節(jié)內(nèi)可見塵細胞、炎細胞和成纖維細胞等，小鼠的肺纖維化程度加重，肺纖維化評分升高，PI3K、Akt 蛋白和mRNA 表達水平降低，進一步證實了miR-489 激活PI3K/Akt 信號通路，降低PI3K、Akt 表達，從而促進肺纖維化的推論，這與靳蘇香等[6]的研究中miR-489 促進矽塵誘導小鼠肺纖維化成熟的結(jié)論一致，均表明miR-489 影響肺纖維化進展。吳秋云[24]的研究亦進行了動物實驗研究，其研究中認為miR-489調(diào)控炎癥通路表達而影響矽塵誘導的肺纖維化，而吸附miR-489 可激活炎癥和纖維化信號通路影響肺纖維化病情，與本研究一致認為miR-489參與肺纖維化發(fā)生發(fā)展，miR-489 干預可作為肺纖維化治療的有效途徑之一。

3.4 不足和展望 綜上所述，通過上調(diào)miR-489助于矽肺誘導小鼠肺纖維化的防治，抑制PI3K/Akt信號通路從而抑制其對小鼠肺纖維化的促進作用是其作用機制，上調(diào)miR-489抑制PI3K/Akt信號通路的藥物研究可作為肺纖維化有效干預的有效方法。但本研究的樣本量較小，且局限于動物小鼠實驗，關于miR-489在人體矽肺導致的肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制仍需進一步研究探討證實。