梁通，宋麗娟，王昀

（中國藥科大學(xué)藥物科學(xué)研究院, 江蘇 南京 211198）

2003年，研究人員意外發(fā)現(xiàn)小分子化合物erastin靶向細胞的電壓依賴性銀離子通道2/3（voltage ependent anion-selective channel，VDAC2/3） 以 非 凋亡死亡形式選擇性殺傷腫瘤細胞，這是鐵死亡首次進入科研人員的視線[1]。直到2018年細胞死亡命名委員會（Nomenclature Committee Cell Death，NCCD）正式將鐵死亡定義為新型細胞死亡，即胞內(nèi)微環(huán)境擾動，鐵依賴性的細胞程序化死亡[2]。通過電鏡觀察細胞腫脹、線粒體凝縮外膜破裂和嵴減少等超微結(jié)構(gòu)變化，是判斷鐵死亡發(fā)生的金標準[3]。細胞死亡后向微環(huán)境中釋放大量的脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物，如丙二醛（malonaldehyde，MDA）和4-羥基壬烯酸（4-hydroxynonenal，4-HNE），顯著增強肝氧化應(yīng)激態(tài)[4]。

普遍認為脂肪變性、鐵超載、氧化應(yīng)激和線粒體功能失調(diào)等是促進非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）發(fā)生發(fā)展的重要原因。目前NAFLD向非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）的轉(zhuǎn)化機制不明，針對NASH的特效治療藥物尚未上市。臨床治療NASH采用運動減肥，并輔用吡格列酮、維生素E等藥物緩解NASH病理表征，但不能完全逆轉(zhuǎn)患者NASH表型[5]，NASH治療亟待發(fā)現(xiàn)新的靶點。2019年日本Minoru Tanaka研究小組在膽堿缺乏同時補充乙硫氨酸的NASH模型小鼠身上發(fā)現(xiàn)，鐵死亡是脂肪肝中最先發(fā)生的細胞死亡形式，特異性抑制肝細胞鐵死亡，肝組織炎癥幾乎被完全抑制[6]。NASH患者臨床檢測結(jié)果顯示血清鐵蛋白和肝鐵過載現(xiàn)象普遍存在[7]，而鐵超載被認為是鐵死亡發(fā)生的生化特征；同時，活性氧（reactive oxygen species，ROS）相關(guān)的氧化應(yīng)激也是NASH發(fā)生發(fā)展的重要參與者，胞內(nèi)的脂質(zhì)代謝失衡導(dǎo)致ROS大量積蓄，是判斷鐵死亡發(fā)生的重要表征[8]。NASH臨床表現(xiàn)出鐵死亡相關(guān)的生化特征，提示鐵死亡可能是臨床患者NAFLD-NASH轉(zhuǎn)化的重要參與者。

1 鐵死亡

鐵在胞質(zhì)內(nèi)大量積蓄，并通過芬頓反應(yīng)（Fenton）生成非酶介導(dǎo)的親酯性ROS，是鐵死亡發(fā)生的必需途徑。使用鐵螯合劑和親脂性抗氧化劑，分別從緩解細胞內(nèi)鐵超載壓力及抑制細胞內(nèi)ROS積蓄2個方面來緩解鐵死亡[9]。迄今為止，通過電鏡觀察線粒體結(jié)構(gòu)超微結(jié)構(gòu)變化依舊是判斷鐵死亡發(fā)生的唯一標準，尚未發(fā)現(xiàn)鐵死亡特異性生物標志物[3]。

1.1 鐵超載促進鐵死亡發(fā)生

維持細胞正常生命活動的前提是必須保證胞內(nèi)鐵離子濃度穩(wěn)態(tài)。當發(fā)生鐵代謝紊亂時，常導(dǎo)致Fe2+在細胞內(nèi)大量積蓄，誘發(fā)鐵死亡。細胞通過轉(zhuǎn)鐵蛋白/轉(zhuǎn)鐵蛋白受體系統(tǒng)將胞外非血紅素鐵導(dǎo)入細胞，沉默轉(zhuǎn)鐵蛋白基因有效緩解細胞內(nèi)鐵超載，顯著抑制細胞鐵死亡[10]。前列腺上皮跨膜蛋白3（six-transmembrane epithelial antigen of the prostate 3，STEAP3）是金屬還原酶家族STEAP一員，具有亞鐵還原酶活性，可將Fe3+還原為Fe2+。敲除STEAP 3基因可顯著減少胞內(nèi)Fe2+積蓄，抑制肝細胞鐵死亡，改善肝移植患者愈后[11]；游離Fe2+以含水氧化鐵納米顆粒的形式安全穩(wěn)定的儲存在鐵蛋白( ferritin light，F(xiàn)T）內(nèi)，是機體維持細胞內(nèi)鐵離子氧化還原動態(tài)平衡的重要策略[12]；高爾基體空泡蛋白分選蛋白（vacuolar protein-sorting protein，VPS）轉(zhuǎn)運系統(tǒng)調(diào)控FT靶向轉(zhuǎn)移到溶酶體，擾亂VPS系統(tǒng)，使得Fe2+在胞內(nèi)大量積蓄，H2O2在Fe2+存在下生成羥基自由基具有強氧化能力，開啟鏈式反應(yīng)，在細胞內(nèi)實現(xiàn)非酶促脂質(zhì)過氧化反應(yīng)生成ROS，細胞鐵死亡敏感性升高[13-14]。

1.2 活性氧積蓄驅(qū)動鐵死亡發(fā)生

鐵死亡被認為是一種脂質(zhì)氫過氧化物積累驅(qū)動的細胞死亡模式[15]。腎上腺皮質(zhì)癌細胞系NCIH295R在正常培養(yǎng)時自發(fā)鐵死亡，需要額外補充轉(zhuǎn)鐵蛋白和硒元素抑制自發(fā)鐵死亡現(xiàn)象。但用加入了轉(zhuǎn)鐵蛋白等添加劑，且富含多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）的培養(yǎng)基培養(yǎng)時，NCI-H295R仍會自發(fā)鐵死亡。通過外源性給予單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）替代PUFA與膜磷脂結(jié)合，膜內(nèi)ROS的積蓄被抑制，細胞表現(xiàn)出抗鐵死亡表型[16-17]。這些研究結(jié)果表明鐵死亡發(fā)生過程中PUFA參與的膜磷脂酰化，是鐵死亡發(fā)生的必要環(huán)節(jié)。

長鏈脂酰輔酶A合成酶4（long chain acyl-coa synthetase 4，ACSL4）是PUFA過氧化上游代謝酶，并在NASH患者中顯著高表達[18]。ACSL4激活PUFA生成乙?；嗖伙柡椭舅? acetylated polyunsaturated fatty acid，PUFA-CoA）。PUFA-CoA在溶血卵磷脂?；D(zhuǎn)移酶3（recombinant lysophosphatidylcholine acyltransferase 3，LPCAT3）等代謝酶的作用下?lián)饺爰毎?，與膜磷脂結(jié)合生成含有PUFA的磷脂分子，摻有PUFA的磷脂分子被細胞質(zhì)內(nèi)O2、ROS等氧化物以非酶氧化方式生成脂質(zhì)氫過氧化物 ( lipid hydroperoxide，LOOH），F(xiàn)e2+通過Fenton反應(yīng)催化脂質(zhì)活性氧（lipid reactive oxygen species，L-ROS）生成，是鐵死亡發(fā)生的必需驅(qū)動力[19-20]。高表達ACSL4，加速PUFA代謝，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物（lipid peroxide，LPO）積蓄誘發(fā)鐵死亡[21-22]。

NASH理論上是NAFLD向肝細胞癌發(fā)展的初始階段，隨著肝組織中脂質(zhì)過度積蓄，造成脂毒性繼而引發(fā)炎癥，約20%的NAFLD患者會進展為NASH，繼而惡化為肝硬化甚至肝癌。隨著經(jīng)濟發(fā)展，人們的物質(zhì)生活水平不斷豐富，該病的發(fā)病率呈上升趨勢。而1980年Ludwig等[23]對NAFLD的定義為“沒有大量酒精攝入時出現(xiàn)的脂肪性肝病”，極易在患者對自己病癥判斷時造成誤導(dǎo)，因此，2020年國際專家組建議以代謝相關(guān)脂肪性肝?。╩etabolic associated fatty liver disease，MAFLD）取代現(xiàn)有命名NAFLD[24]。MAFLD是一類慢性肝病的統(tǒng)稱，包括單純性脂肪肝、NASH、肝纖維化、肝硬化和肝細胞癌。MAFLD近年來患病率逐年上升，2020年全球有近10億人患病，對社會醫(yī)療和經(jīng)濟造成了劇烈沖擊，成為世界性公共衛(wèi)生問題。令人擔憂的是，越來越多的兒童和青少年被診斷出MAFLD，并可能伴有與MAFLD密切相關(guān)的肝臟和心血管并發(fā)癥甚至惡性腫瘤。NASH是MAFLD中的轉(zhuǎn)折點，病情進展到NASH期，普適的臨床治療手段失去效果，當病情進展到終末期時，高風(fēng)險肝移植成為唯一治療手段，并且術(shù)后可能再次復(fù)發(fā)。NASH是一個復(fù)雜的失調(diào)性疾病，其復(fù)雜的發(fā)病機制導(dǎo)致NASH亞型的多元性，目前臨床上把病人簡單分為NASH和非NASH已經(jīng)不再適合NASH臨床治療，這不僅要求NASH的臨床診斷手段需要具有極高的靈敏性，更要求廣大的基礎(chǔ)藥學(xué)研究者們需要更多的研究來描述NASH疾病的全貌，精準定義疾病的亞型。使得臨床醫(yī)生得到患者的診斷結(jié)果后，可以根據(jù)不同NASH亞型致病因素的區(qū)別進行合理的判斷，實現(xiàn)精準藥物治療。

2 非酒精性脂肪性肝炎的診斷和治療

肝組織活檢是臨床檢測NASH的金標準，以大泡性或以大泡性為主的混合型肝細胞脂肪變性為主要診斷特征[25]。肝活檢耐受性差，容易出現(xiàn)肝組織出血等并發(fā)癥。臨床患者急需無不良反應(yīng)且耐受性好的無創(chuàng)檢測手段，如血清生化檢查、影像學(xué)檢查等方法。臨床使用核磁共振質(zhì)子檢測密度脂肪分數(shù)對肝臟脂肪含量進行定量，使用磁共振彈性成像和瞬時彈性成像等技術(shù)對肝纖維化指數(shù)和血生化指標進行檢測，以上綜合評定NASH進展程度的方法在臨床實踐中表現(xiàn)出替代肝活檢檢測NASH的潛力[26]。

與飛速發(fā)展的診斷手段相比，有關(guān)NASH的發(fā)病機制的研究進展緩慢。雖然有新的假說提出，也僅僅是從“二次打擊理論”認為的脂類在肝臟細胞的細胞質(zhì)內(nèi)的聚集（第1次打擊）觸發(fā)了一系列的細胞毒素事件（第2次打擊），導(dǎo)致了肝臟的炎癥反應(yīng)，發(fā)展為“多次打擊理論”認為的NASH的發(fā)生發(fā)展是多種因素共同“努力”的結(jié)果，包括胰島素抵抗、脂肪組織分泌的激素、營養(yǎng)因子、腸道菌群釋放的內(nèi)毒素（脂多糖）、鐵沉積和氧化應(yīng)激損傷等，這些因素作用于肝實質(zhì)細胞，從而驅(qū)動NASH的發(fā)展[27]。這并沒有進一步闡述脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、炎癥和肝臟病變之間的潛在聯(lián)系及調(diào)控機制。NASH藥物研究的靶點主要從代謝、抗炎和抗纖維化3個方面選取靶點。這些藥物雖然針對NASH纖維化階段的治療效果優(yōu)異，能緩解NASH發(fā)展，并一定程度上改善患者病癥，降低并發(fā)癥的發(fā)生率，但是仍不能實現(xiàn)NASH到健康的逆轉(zhuǎn)[28]。本文統(tǒng)計了通過改變生活方式以及近期靶向上述靶點治療NASH的藥物的臨床研究現(xiàn)狀（見表1）。

表1 非酒精性脂肪性肝炎藥物臨床研究進展Table 1 Progress of clinical research on drugs against non-alcoholic steatohepatitis

3 鐵死亡與非酒精性脂肪性肝炎

現(xiàn)在NASH的臨床治療藥物多是靶向代謝、炎癥或纖維化角度選取的治療靶點，雖然可以緩解NASH纖維化等部分表征，但是無法徹底治愈NASH，并且用藥時常伴有強烈的不良反應(yīng)，因此，臨床醫(yī)生們迫切需要療效強、不良反應(yīng)弱的治療藥物治療NASH。而藥學(xué)工作中需要做的就是為他們提供靶向性更強更有效的新型治療靶點。2019年Tsurusaki等[6]在小鼠的膽堿缺乏同時補充乙硫氨酸的飲食模型中發(fā)現(xiàn)，使用鐵螯合劑deferiprone可以顯著地緩解脂肪性肝炎發(fā)生時的臨床癥狀和血生化指標，幾乎完全阻止肝炎的發(fā)生，證實鐵死亡是NASH發(fā)生發(fā)展的重要參與者。同時Tsuchida等[35]在蛋氨酸膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠模型中證實了鐵死亡的發(fā)生，給予鐵死亡抑制劑后，肝細胞內(nèi)脂滴堆積減少，肝脂肪變性顯著改善。在臨床表征與NASH患者最接近的高糖高脂模型中，額外給予低鐵飼料飼養(yǎng)的模型小鼠，細胞鐵死亡敏感性降低，NASH的發(fā)展被限制[36]。鐵死亡的細胞的多種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物作為預(yù)炎性物質(zhì)促進NASH發(fā)生發(fā)展，如大量的ROS引起的炎癥可能是NASH發(fā)病機制之一，通過羅格列酮抑制ACSL4，減少肝組織內(nèi)氧化應(yīng)激態(tài)，緩解NASH發(fā)生發(fā)展[37-40]。這些證據(jù)顯示鐵死亡與NASH的發(fā)生發(fā)展可能息息相關(guān)。

3.1 鐵過載誘發(fā)鐵死亡誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝炎發(fā)生發(fā)展

十二指腸腸上皮細胞經(jīng)過二價金屬離子轉(zhuǎn)運體-1（divalent metal-ion transporter-1，DMT1） 吸收飲食中的Fe3+，同時將Fe3+還原成Fe2+，通過膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白（ferroportin，F(xiàn)PN）外排進血液，在血液中與鐵蛋白結(jié)合形成血紅素鐵轉(zhuǎn)運到身體各處[41]。肝門脈循環(huán)的首過效應(yīng)，使得肝臟鐵暴露量遠大于其他組織，導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)功能病理變化，造成肝損傷和多種并發(fā)癥[42-43]。

臨床檢測發(fā)現(xiàn)慢性肝病常伴有血清鐵蛋白升高，血清鐵蛋白是臨床檢測機體鐵穩(wěn)態(tài)的生物標志物，當血清中鐵蛋白含量異常時，肝臟作為負責(zé)清除血清鐵蛋白的臟器超負荷運轉(zhuǎn)進一步加重了肝臟損傷[38]。間質(zhì)隔室檢測出鐵超載的MAFLD患者進展為NASH的風(fēng)險高于其他亞型[44]。另一方面，肝臟是機體內(nèi)重要的鐵庫，約占機體儲存鐵含量1/3，肝組織鐵代謝失調(diào)導(dǎo)致大量游離鐵的產(chǎn)生，肝組織細胞對鐵死亡的敏感性顯著提升[45]。胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵成分增加，通過Fenton化學(xué)反應(yīng)和哈伯-韋斯（Haber-Weiss）反應(yīng)促進了高反應(yīng)性自由基（例如羥基自由基）的形成，誘導(dǎo)了長鏈PUFA的消耗，促進輕度微泡產(chǎn)生和大泡脂肪變性從而誘發(fā)肝脂肪變性和炎癥，缺鐵飲食和使用維生素E等抗氧化劑可顯著緩解肝病的發(fā)生發(fā)展[46-49]；NASH患者組織切片顯示炎癥相關(guān)巨噬細胞聚集處是從門脈三叉向周圍區(qū)域擴散，分布模式與肝鐵沉積模式相似[50]。高膽固醇飲食（high cholesterol-containing diet，HFCD）NASH模型小鼠中鐵調(diào)素mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，大量肝細胞FPN降解，細胞鐵含量過載，肝細胞鐵死亡敏感性顯著升高[51-52]，鐵超載刺激脂滴形成導(dǎo)致肝脂肪變性、巨噬細胞M1活化、促進肝纖維化、促進NASH發(fā)展[53-54]。

3.2 活性氧所致的鐵死亡誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝炎發(fā)生發(fā)展

將PUFA的氧化物摻入磷脂中是鐵死亡的核心步驟，儲存有大量脂滴的肝細胞，受到外界刺激引起代謝異常，鐵死亡敏感性升高[20,55]，研究證明鐵死亡是脂肪變性的結(jié)果之一。細胞死亡后向外界環(huán)境中釋放出大量的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，促進炎癥發(fā)展。過氧化次級產(chǎn)物MDA和 4-HNE參與NASH發(fā)生發(fā)展的所有階段，是NASH多種組織學(xué)特征的“始作俑者”[56]。

肝細胞脂滴內(nèi)沉積大量PUFA激活肝細胞線粒體應(yīng)激，破壞線粒體呼吸鏈功能，直接導(dǎo)致線粒體產(chǎn)生大量ROS[57]，同時觸發(fā)相鄰線粒體ROS產(chǎn)生與釋放，不同空間位置的線粒體，通過特殊的ROS介導(dǎo)的信號傳輸網(wǎng)絡(luò)相互串擾激活，使得細胞內(nèi)的氧化還原失衡的信號在這些網(wǎng)絡(luò)中傳播放大，加速細胞內(nèi)ROS積蓄，從而細胞對鐵死亡敏感性升高[40,58]。細胞死亡后釋放出大量的ROS，改變肝細胞生存環(huán)境，進一步促進細胞發(fā)生鐵死亡、凋亡或自噬，從而促進炎癥和肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[59]。

3.3 其他

NASH患者ACSL4蛋白表達水平顯著升高，ACSL4優(yōu)先選擇將花生四烯酸( arochidonic acid，AA）?；龠MAA與膜磷脂結(jié)合形成花生四烯酸?；哪ち字肿?，細胞對鐵死亡敏感性升高[25]。敲除ACSL4基因后，細胞對鐵死亡誘導(dǎo)劑的敏感性顯著降低，緩解肝損傷[60]。

蒿甲醚通過促進肝星狀細胞 （hepatic stellate cell，HSC）的鐵和脂質(zhì)過氧化物的積累觸發(fā)鐵死亡發(fā)揮抗纖維化作用，給予比酚類抗氧化劑鐵抑素-1（ferrostatin-1，F(xiàn)er-1）抑制鐵死亡后，蒿甲醚就喪失抗纖維化作用[61]；索拉菲尼在治療晚期肝癌時，上調(diào)胚胎期致死異常視覺果蠅樣1/Hu 抗原R（embryonic lethal abnormal vision drosophila-like 1/Hu antigen R，ELAVL1/HuR）表達和下調(diào)ZFP36表達，從而增強HSC對鐵死亡的敏感性，促進HSC鐵死亡，并抑制HSC活化，減輕肝纖維化[62-63]。

肝細胞鐵死亡后釋放出大量鐵離子，巨噬細胞回收大量鐵離子后，胞內(nèi)鐵積累會促進巨噬細胞向促炎癥方向極化、以及通過Toll樣受體4（toll like receptor4，TLR4）/β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TRIF）通路促進腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎因子的表達。此外，鐵元素還被報道可以調(diào)控巨噬細胞內(nèi)的三羧酸循環(huán)（TCA），進而調(diào)控細胞因子的產(chǎn)生[64]；擾亂肝駐留巨噬細胞對炎癥區(qū)域調(diào)節(jié)能力，大量促炎因子釋放到外周血內(nèi)，并募集大量免疫細胞到受損區(qū)域，鐵過載也會提升T細胞內(nèi)ROS水平，造成DNA損傷、降低T細胞響應(yīng)能力。在分子機制上，鐵離子可以在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控層面調(diào)控細胞因子的產(chǎn)生、可能通過Tet蛋白負調(diào)控DNA甲基化、通過細胞色素的氧化還原過程調(diào)控T細胞線粒體功能[65]，進一步促進炎癥發(fā)生發(fā)展。

4 結(jié)語與展望

NAFLD是世界上許多地方引起慢性肝病的主要原因，2020年我國一般人群中患病率為29.81%[66]。迄今為止，中國市場上尚無藥物被批準用于臨床治療NASH[33]，臨床主流治療手段是調(diào)節(jié)性飲食運動與藥物輔助治療相結(jié)合，但是由于安慰劑效應(yīng)和患者個體性差異等原因，目前缺少確切的實驗數(shù)據(jù)證明運動及飲食療效的優(yōu)秀和穩(wěn)定[33]。

鐵死亡作為一種脂質(zhì)過氧化依賴性細胞死亡，細胞死亡后釋放出大量的脂質(zhì)過氧化物，從這些化學(xué)物質(zhì)角度分析可以解釋許多臨床NASH患者病理性的組織學(xué)結(jié)構(gòu)。并且NASH患者檢測出的鐵超載狀態(tài)以及與脂質(zhì)過氧化物表征，與肝炎發(fā)展密不可分。進一步對鐵死亡機制進行深入研究，有望為發(fā)現(xiàn)新的NASH治療靶點提供新的研究方向。