張國明 丁立成 孫廣峰 留志賢 王斌 孫媛媛

（廈門大學(xué)附屬心血管病醫(yī)院 福建廈門361009）

近年來越來越多研究顯示，遠(yuǎn)隔缺血時(shí)適應(yīng)是一種可行的、安全的心臟保護(hù)措施，能夠改善預(yù)后[1]。遠(yuǎn)隔缺血時(shí)適應(yīng)主要是對遠(yuǎn)隔臟器，如肢體循環(huán)進(jìn)行短暫性缺血再灌注，使其產(chǎn)生一定的適應(yīng)性，減輕心、腦等重要器官發(fā)生致命性缺血受損。已有研究證實(shí)，遠(yuǎn)隔缺血時(shí)適應(yīng)的作用機(jī)制主要是通過阻斷線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）開放，避免細(xì)胞受損來實(shí)現(xiàn)的[2]。但也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)隔缺血時(shí)適應(yīng)選擇器官數(shù)量不同，其心臟保護(hù)作用可能存有差異[3]。本研究將進(jìn)一步分析多器官遠(yuǎn)隔缺血時(shí)適應(yīng)對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響，并分析其與線粒體細(xì)胞凋亡途徑的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料60只SD雄性大鼠，體質(zhì)量180~250 g，自由飲食水，飼養(yǎng)室內(nèi)溫濕度適宜，光線充足。Caspase-3、Bax、Cx43、PKC-ε抗體來源于美國Sagma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血/再灌注損傷對照組、標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械后適應(yīng)組、單器官遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組、雙器官遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組、三器官遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組六組，每組10只。

1.3 構(gòu)建大鼠心肌缺血再灌注損傷模型 除了假手術(shù)組，其余組別建立大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，具體方法：經(jīng)大鼠腹腔注射70 mg/kg 1%戊巴比妥鈉，待其睫毛反射消失、肌肉松弛時(shí)提示麻醉起效，將大鼠固定在解剖臺上。對頸部皮膚進(jìn)行常規(guī)消毒，并將頸部皮膚縱向切口以使第二、第三氣管環(huán)顯露，進(jìn)行氣管切開術(shù)，予以氣管插管和連接呼吸機(jī)，機(jī)械通氣參數(shù)設(shè)置：呼吸頻率65次/min，潮氣量2.5 ml/100 g，呼吸比1:1。然后在大鼠的右后肢、左側(cè)前后肢體置入心電圖電極以行心電圖監(jiān)測。與此同時(shí)，充分顯露大鼠的右頸總動脈，置入22G套管針，連接動脈壓力套裝連續(xù)測定大鼠頸動脈血壓。然后顯露右頸內(nèi)靜脈，置入22G套管針將其與微量輸液泵相連接，用于補(bǔ)液或術(shù)中給藥。對大鼠的左側(cè)胸壁進(jìn)行消毒，在胸骨左緣處沿胸骨方向剪開皮膚至第五肋間水平，再從胸骨旁水平向腋窩剪開皮膚，鈍性分離胸部肌肉并剪開至第四肋肋間肌。將心包膜撕開使心臟暴露，察看心臟前壁、左心耳形態(tài)結(jié)構(gòu)。在心臟表面可察看到從心底部發(fā)出的左冠狀動脈前降支，用5-0縫合線從左心耳中點(diǎn)下緣左冠狀動脈前降支左側(cè)進(jìn)針，右側(cè)出針，深度1 mm。然后在縫合線兩頭穿過長1 cm的連接管以免線頭滑落。經(jīng)右頸總動脈注射少量肝素，預(yù)防血栓形成。將浸有肝素生理鹽水的1 mm棉絮放置在心肌表面和縫合線之間，以將左冠狀動脈前降支進(jìn)行結(jié)扎。再向下推動連接管，將棉絮一起壓向左冠狀動脈前降支，并用血管鉗固定阻斷左冠狀動脈前降支血流實(shí)施缺血。松開血管鉗即可恢復(fù)左冠狀動脈前降支血流實(shí)施再灌注。

1.4 干預(yù)方法 建模成功24 h后實(shí)施干預(yù)。（1）假手術(shù)組：建模步驟參考上述心肌缺血再灌注損傷模型操作流程，但其分離左冠狀動脈和左側(cè)股動脈并穿線后不結(jié)扎，40 min后關(guān)閉大鼠胸腔。（2）缺血/再灌注損傷對照組：冠脈實(shí)施40 min缺血后即完全松開阻塞球囊恢復(fù)完全再灌注，分離左側(cè)股動脈并穿線后不結(jié)扎。（3）標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械后適應(yīng)組：冠脈實(shí)施40 min球囊阻塞缺血后，每隔30 s松開阻塞球囊30 s，共3次，至恢復(fù)完全再灌注；分離左側(cè)股動脈并穿線后不結(jié)扎。（4）單器官遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組：冠脈實(shí)施40 min球囊阻塞缺血后即完全松開阻塞球囊恢復(fù)完全再灌注，分離左側(cè)股動脈并穿線，在冠脈結(jié)扎時(shí)結(jié)扎股動脈5min，而后再灌注5min，反復(fù)進(jìn)行4個(gè)循環(huán)。（5）雙器官遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組：處理同單器官遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組，但其遠(yuǎn)隔器官為雙側(cè)后肢。（6）三器官遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組：處理同單器官遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組，但其遠(yuǎn)隔器官為雙側(cè)后肢和右側(cè)前肢。

1.5 觀察指標(biāo) （1）比較各組心肌細(xì)胞壞死率、線粒體腫脹程度。應(yīng)用TUNEL法檢測心肌細(xì)胞壞死率，并應(yīng)用電鏡觀察心肌組織線粒體的超微結(jié)構(gòu)。（2）比 較 各 組 心 臟 組 織Caspase-3、Bax、Cx43、PKC-ε蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，經(jīng)大鼠右頸總動脈注射10%氯化鉀溶液2 ml將大鼠處死，取出心臟應(yīng)用蛋白免疫印跡法進(jìn)行檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 選用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（±s）描述，兩組對比經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細(xì)胞壞死率比較 與缺血/再灌注損傷對照組相比，標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械后適應(yīng)組、單器官遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組、雙器官遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組、三器官遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組的心肌細(xì)胞壞死率顯著降低，且三器官遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組的細(xì)胞壞死率最低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組心肌細(xì)胞壞死率比較（%，±s）

表1 各組心肌細(xì)胞壞死率比較（%，±s）

注：與假手術(shù)組對比，*P＜0.05；與缺血/再灌注損傷對照組對比，#P＜0.05；與標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械后適應(yīng)組對比，&P＜0.05；與單器官遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組對比，△P＜0.05；與雙器官遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組對比，※P＜0.05。

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2.2 各組心臟組織Caspase-3、Bax、Cx43、PKC-ε蛋白表達(dá)水平比較 單器官遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組、雙器官遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組、三器官遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組大鼠心臟組織Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平明顯低于缺血/再灌注損傷對照組、標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械后適應(yīng)組（P＜0.05），Cx43、PKC-ε蛋白表達(dá)明顯高于缺血/再灌注損傷對照組、標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械后適應(yīng)組（P＜0.05）；單器官遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組、雙器官遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組、三器官遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組上述基因蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組心臟組織Caspase-3、Bax、Cx43、PKC-ε蛋白表達(dá)水平（±s）

表2 各組心臟組織Caspase-3、Bax、Cx43、PKC-ε蛋白表達(dá)水平（±s）

注：與假手術(shù)組對比，*P＜0.05；與缺血/再灌注損傷對照組對比，#P＜0.05；與標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械后適應(yīng)組對比，&P＜0.05。

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3 討論

有研究顯示，遠(yuǎn)隔缺血時(shí)適應(yīng)的心肌保護(hù)機(jī)制與線粒體途徑作用有關(guān)，其能夠阻止mPTP開放，避免因mPTP開放而造成線粒體、心肌細(xì)胞受損，而且線粒體途徑還可以為短暫再灌注治療提供少量活性氧，進(jìn)而通過激活線粒體ATO鉀離子通道而阻止mPTP開放，故其具有良好的心肌保護(hù)作用[4]。Caspase-3、Bax、Cx43、PKC-ε為常見的線粒體調(diào)控因子。本研究結(jié)果顯示，單器官遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組、雙器官遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組、三器官遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組大鼠心臟組織的上述各項(xiàng)因子表達(dá)水平優(yōu)于缺血/再灌注損傷對照組、標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械后適應(yīng)組，進(jìn)一步表明與標(biāo)準(zhǔn)后適應(yīng)模式相比，遠(yuǎn)隔缺血時(shí)適應(yīng)模式能夠更好地發(fā)揮心肌保護(hù)作用，有效減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷，這可能是通過調(diào)節(jié)線粒體細(xì)胞凋亡途徑來實(shí)現(xiàn)的。此外，本研究單器官遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組、雙器官遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組、三器官遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組的Caspase-3、Bax、Cx43、PKC-ε蛋白表達(dá)值無明顯的差異，提示遠(yuǎn)隔適應(yīng)的器官數(shù)目與保護(hù)作用無明顯累加效應(yīng)。