付信珍，丁振，李志，謝則平，張淑敏，寇立娟

濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 煙臺 264003

人參皂苷是一種四環(huán)三萜類化合物，被視為是人參中的藥理活性成分［1］；按其結(jié)構(gòu)可分為原人參二醇型、原人參三醇型和齊墩果酸型，其中，20（S）-原人參二醇［20（S）-PPD］是二醇型人參皂苷在動物體內(nèi)經(jīng)胃腸道微生物菌群代謝產(chǎn)生的活性最強(qiáng)的有效藥物成分［2］。近年來，由于其在抗腫瘤、抗炎、抗氧化、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)與激活免疫系統(tǒng)方面發(fā)揮重要的藥理作用，得到了研究學(xué)者的廣泛關(guān)注［3-4］。創(chuàng)新藥物研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷類藥物的口服生物利用度低，在血漿中濃度較低，因此建立高靈敏度、高準(zhǔn)確度的檢測方法非常關(guān)鍵［5-6］。

目前，血漿中20（S）-PPD 提取處理常采用液液萃取法或固相萃取法［7-8］。這兩種方法雖然能凈化樣品基質(zhì)，但實(shí)驗(yàn)需要的有機(jī)溶劑用量大，且過程中涉及旋蒸和氮吹步驟，操作煩瑣，容易造成目標(biāo)物質(zhì)的損失，往往需要大量的方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。蛋白沉淀法可最大程度保留代謝物質(zhì)，操作簡單快速，對環(huán)境友好，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥物代謝研究［9-10］，如吳悅等［9］采用乙腈蛋白沉淀法提取血漿中阿帕替尼，結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）實(shí)現(xiàn)了其藥動學(xué)研究。然而，將蛋白沉淀法應(yīng)用于血漿樣品中20（S）-PPD 的分析鮮見有報道。

20（S）-PPD 的分析方法主要包括液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［6,8］。與高效液相色譜法相比，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法由于分析速度快、選擇性與專屬性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于復(fù)雜樣品基質(zhì)中人參皂苷類化合物的分析。本研究采用蛋白沉淀法處理血漿樣品，UPLC-MS/MS 法測定大鼠血漿中20（S）-PPD，并將此方法應(yīng)用于大鼠灌胃20（S）-PPD 的藥動學(xué)研究，為其創(chuàng)新藥物研究提供技術(shù)支持。

1 材料

1.1 主要儀器

ACQUITY 超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；QTRAP 6500+三重四極桿質(zhì)譜儀（美國SCIEX 公司）；CHORUS 1 COMPLETE 型超純水儀（英國ELGA 公司）；MS105DU 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；SH8200H 型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；FRESCO 21 型高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo 公司）；TARGIN VX-Ⅱ型渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）。

1.2 藥物及主要試劑

原人參二醇（純度≥96%，中國食品藥品檢定研究院）；齊墩果酸（分析對照品，麥克林試劑公司）；甲醇和乙腈（色譜純，德國Merk 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級SD 大鼠6 只，雄性，體質(zhì)量范圍180 g～220 g，購于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（魯）20190003。飼養(yǎng)環(huán)境室溫20～26 ℃，日溫差≤4 ℃，相對濕度40%～70%，明暗交替時間為12/12 h。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取20（S）-PPD 和齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別用色譜純甲醇溶解并定容至10 mL，配制成濃度為1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。使用時以甲醇逐級稀釋成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2 血漿樣品處理方法

取灌胃給藥后大鼠血漿45 μL 于1.5 mL 尖底聚丙烯離心管內(nèi)，然后加入濃度為2 μg/mL 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)齊墩果酸5 μL，準(zhǔn)確加入0.05%甲酸/乙腈150 μL，渦旋震蕩3 min，以4 ℃、10 000 r/min 離心10 min 后，取上清液供UPLC-MS/MS 分析。

2.3 UPLC-MS/MS 檢測條件

色譜條件：色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速：0.40 mL/min；流動相：水-乙腈（2∶8）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，負(fù)離子掃描；離子源溫度：500 ℃；噴霧電壓：-4 500 V；氣簾氣流速：20 psi；霧化氣流速：50 psi；脫溶劑氣流速：50 psi；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描；20（S）-PPD 及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)齊墩果酸多反應(yīng)監(jiān)測色譜-質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 20（S）-PPD及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)齊墩果酸的質(zhì)譜分析參數(shù)

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

本實(shí)驗(yàn)參照《中國藥典》2020 版第四部生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容。

2.5 藥動學(xué)研究

SPF 級SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d～5 d。給藥前夜禁食不禁水，給藥后持續(xù)禁食。配制濃度為5.0 mg/mL 20（S）-PPD 水溶液（含0.3%乙醇），將上述溶液按35 mg/kg 的給藥劑量灌胃至大鼠體內(nèi)，于給藥前和給藥后5 min、15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 于眼眶采血，采用肝素鈉抗凝管收集血液約0.5 mL，采用3 000 r/min 離心10 min，收集血漿于-80 ℃保存待用。

上述大鼠血漿樣品采用“2.2”方法進(jìn)行處理，采用“2.3”方法檢測20（S）-PPD 的含量，測定結(jié)果使用Phoenix WinNonlin（版本8.1）進(jìn)行藥代參數(shù)分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

采用乙腈作為蛋白沉淀劑在血漿樣品藥物含量測定應(yīng)用非常廣泛，當(dāng)乙腈-血漿（3∶1），可將血液中蛋白質(zhì)去除完全。本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)采用乙腈作為蛋白沉淀劑時，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)齊墩果酸峰形狀差，無法實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量分析；考察了含0.05%和0.1%甲酸/乙腈作為蛋白沉淀劑對20（S）-PPD 和內(nèi)標(biāo)物齊墩果酸的影響，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，當(dāng)含0.1%甲酸/乙腈溶液作蛋白沉淀劑時，雖然內(nèi)標(biāo)物質(zhì)齊墩果酸峰形尖銳，質(zhì)譜響應(yīng)信號增大，但20（S）-PPD的質(zhì)譜響應(yīng)信號明顯降低，僅為含0.05%甲酸/乙腈作蛋白沉淀劑時質(zhì)譜信號的20%左右。綜合考慮，選擇含0.05%甲酸/乙腈作為蛋白沉淀劑和樣品提取劑。

圖1 提取溶劑對20（S）-PPD和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)譜響應(yīng)影響：A.乙腈；B.0.05%甲酸/乙腈；C.0.1%甲酸/乙腈

3.2 色譜分離條件的選擇

考察了水/乙腈、甲酸/乙腈和乙酸銨/乙腈作為流動相對20（S）-PPD 和齊墩果酸的色譜分離及質(zhì)譜響應(yīng)影響，結(jié)果見圖2。由圖可知，當(dāng)采用0.1%甲酸-乙腈（20∶80）和1 mmol/L 乙酸銨-乙腈（20∶80）作為流動相時，20（S）-PPD 和齊墩果酸的質(zhì)譜響應(yīng)信號明顯降低，考慮到方法靈敏度，選擇水/乙腈體系作為流動相體系。

圖2 流動相對20(S)-PPD和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)譜響應(yīng)影響：A.水/乙腈；B.0.1%甲酸/乙腈；C.1 mmol/L乙酸銨/乙腈

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 專屬性取6 批次空白大鼠血漿50 μL 除不加內(nèi)標(biāo)物質(zhì)外，其余按“2.2”方法進(jìn)行處理；另取空白大鼠血漿45 μL，加入20（S）-PPD 和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)濃度同為2 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液5 μL，另取大鼠給藥后的血漿樣品50 μL，按“2.2”方法進(jìn)行處理；處理后血漿按“2.3”方法進(jìn)行分析。大鼠給藥后血漿樣品中20（S）-PPD 和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)分離良好，出峰情況和加標(biāo)樣品一致，且空白大鼠血漿樣品中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾代謝物質(zhì)測定，方法選擇性和專屬性好。

3.3.2 線性范圍及定量下限分別精密量取空白大鼠血漿45 μL，加入5 μL 20（S）-PPD 和齊墩果酸的混合溶液，配制20（S）-PPD 濃度為1、2.5、5、10、25、50、100、250、500、1 000 和2 500 ng/mL的血漿樣品，內(nèi)標(biāo)物濃度均為200 ng/mL。結(jié)果表明，20（S）-PPD 在1～2 500 ng/mL 的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性（r≥0.998），按信噪比S/N=10 計(jì)算，血漿中最低定量下限為0.5 ng/mL，方法靈敏度高、線性范圍寬，可以滿足20（S）-PPD 藥物研發(fā)、臨床檢測等需要。

3.3.3 準(zhǔn)確度及精密度本研究配制高濃度質(zhì)控樣品（HQC）、中濃度質(zhì)控樣品（MQC）、低濃度質(zhì)控樣品（LQC）及定量下限（LLOQ）4 個濃度的血漿樣品，進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)（n=5）。批間精密度實(shí)驗(yàn)時，2 天內(nèi)進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)3 批次，計(jì)算n=15 的精密度。分析結(jié)果見表2，血漿中20（S）-PPD 的批內(nèi)批間準(zhǔn)確度在±12.2%以內(nèi)，批內(nèi)與批間精密度≤15%，方法準(zhǔn)確度高、精密度好，符合分析方法的要求。

表2 大鼠血漿樣品中20（S）-PPD分析方法的準(zhǔn)確度和精密度

3.3.4 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率將大鼠空白血漿樣品按“2.2”方法（不加內(nèi)標(biāo)）進(jìn)行提取處理后得到基質(zhì)空白，然后取上述基質(zhì)空白45 μL，加入5 μL 20（S）-PPD 及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，配制高、中、低濃度質(zhì)控樣品，再加150 μL 基質(zhì)空白，渦旋后離心，進(jìn)樣分析，記錄峰面積為A；甲醇溶液配制相同高、中、低濃度對照樣品，再加150 μL 乙腈，渦旋進(jìn)樣分析，記錄峰面積為B；通過二者峰面積比觀察是否有基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表3。大鼠血漿基質(zhì)中20（S）-PPD經(jīng)樣品前處理后，基質(zhì)效應(yīng)在87.3%～104.8%內(nèi)，內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子的變異系數(shù)CV 小于3.6%，可以滿足分析需求。

取大鼠空白血漿45 μL，加入5 μL 20（S）-PPD和齊墩果酸的混合溶液，配制高、中、低濃度質(zhì)控樣品，然后按照“2.2”方法進(jìn)行處理，進(jìn)樣分析，記錄峰面積為C。通過C/A 計(jì)算方法提取回收率。表3 結(jié)果可知，提取回收率在84.8%～94.1%，精密度均小于10.4%，滿足分析方法需求。

表3 大鼠血漿樣品中20（S）-PPD的回收率與基質(zhì)效應(yīng)

3.3.5 樣品穩(wěn)定性取大鼠空白血漿45 μL，加入5 μL 20（S）-PPD 和齊墩果酸的混合溶液，配制高、低濃度質(zhì)控樣品，考察了血漿樣品室溫放置4 h 后提取處理，10 ℃自動進(jìn)樣器放置24 h 及兩周內(nèi)三次凍融循環(huán)后20（S）-PPD 的穩(wěn)定性。從表4 可以看出，經(jīng)上述條件存放后，20（S）-PPD 和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的穩(wěn)定性在±14.3%以內(nèi)，精密度在8.7%以內(nèi)，可以滿足分析需要。

表4 大鼠血漿樣品中20（S）-PPD穩(wěn)定性結(jié)果

3.3.6 稀釋效應(yīng)樣品測定時有的樣品濃度會超出方法的線性范圍，需對樣品進(jìn)行稀釋再測定。本方法配制了5 000 ng/mL 和10 000 ng/mL 的血漿樣品，考察了血漿樣品稀釋后的穩(wěn)定性結(jié)果表明，高濃度樣品稀釋5 倍和10 倍后，樣品穩(wěn)定性良好，準(zhǔn)確度在97.4%～99.1%之間，符合方法學(xué)要求。

3.4 藥動學(xué)研究

20（S）-PPD 血藥濃度隨時間變化曲線如圖3所示，藥代動力學(xué)參數(shù)采用非房室模型進(jìn)行計(jì)算。大鼠灌胃給藥后，血漿中20（S）-PPD 的Cmax、tmax、t1/2和AUC0-∞分別為3 520 ng/mL、2 h、10.65 h和21 760 ng·mL-1·h-1。

圖3 灌胃20（S）-PPD后大鼠血漿中20（S）-PPD的血藥濃度-時間曲線

4 結(jié)論

本研究系統(tǒng)考察了血漿樣品中20（S）-PPD 前處理方法與檢測條件，結(jié)果表明本方法操作簡單、線性范圍寬、定量限低，準(zhǔn)確度及精密度好，提取回收率高，基質(zhì)效應(yīng)較小，滿足血漿樣品基質(zhì)中20（S）-PPD 的定性定量分析需求；利用建立的分析方法成功應(yīng)用于20（S）-原人參二醇在大鼠體內(nèi)的代謝動力學(xué)評價研究，結(jié)果表明20（S）-PPD在大鼠體內(nèi)的吸收、消除較快，從而為20（S）-原人參二醇藥物研發(fā)及臨床用藥研究提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)支持。