吳良發(fā),許妍,鄭盈瑩,姜軍華
江西省藥品檢驗檢測研究院,國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室,江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心,江西 南昌 330029
大七厘丸、大七厘片、大七厘膠囊、大七厘散屬于同方制劑,均由自然銅、硼砂、大黃等十一味藥材全部以生藥粉投料制成,各品種現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)對重金屬控制項目各不相同,大七厘散無總重金屬檢查項,大七厘丸無總重金屬但有酸可溶性重金屬檢查項,而大七厘膠囊和大七厘片有總重金屬檢查項且限量要求不一樣(大七厘膠囊規(guī)定含總重金屬量不得過百萬分之三十,大七厘片規(guī)定含總重金屬量不得過百萬分之十、含砷量不得過百萬分之二)。由于含有礦物藥,大七厘膠囊和大七厘片制定的重金屬限量過于嚴(yán)格,總重金屬和砷含量常出現(xiàn)不合格情況。重金屬控制指標(biāo)和限量不合理以及標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一造成品種之間不公平競爭,因此,有必要建立大七厘制劑中重金屬含量測定的通用方法。
自然銅和硼砂是常用礦物藥,在發(fā)揮藥效的同時伴生的重金屬元素易在體內(nèi)積蓄,對人體有一定的危險,影響人體正常的生理功能[1]。目前,文獻(xiàn)報道多集中在重金屬總量方面的研究[2-5],而有關(guān)可溶性重金屬方面的研究較少,尚未見大七厘制劑中可溶性重金屬的研究。本文建立ICP-MS 法測定大七厘制劑中可溶性重金屬的含量,為含礦物中成藥中重金屬限量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供參考依據(jù)。
電感耦合等離子質(zhì)譜儀ICP-MS(型號:Agilent 7700),微波消解儀(型號:MARS-Xpress),超聲波清洗器(型號:KQ-500E),萬分之一電子天平(型號:ML204),低速臺式離心機(型號:TDL-40C)。
銅、砷、鉛、鎘混合元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(5283-4682,10 μg/mL)、汞單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(10-37HGY2,10 μg/mL)以及鋰、鈧、鍺、銦、鉍混合內(nèi)標(biāo)儲備液(5188-6525,100 μg/mL)均購自美國安捷倫公司;人發(fā)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW09101)購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心;硝酸為優(yōu)級純試劑,胰酶為生化試劑,試驗用水為超純水。所用玻璃儀器均以20%硝酸溶液浸泡24 h,再用去離子水沖洗干凈。
4 家企業(yè)的22 批樣品,包括11 批大七厘丸(江西仁豐藥業(yè)有限公司,規(guī)格:每丸重0.2 g);2 批大七厘片(江西桔王藥業(yè)有限公司,規(guī)格:每片重0.35 g);3 批大七厘散(廈門中藥廠有限公司,規(guī)格:每袋裝1.5 g);6 批大七厘膠囊(江西昂泰制藥有限公司,規(guī)格:每粒重0.3 g)。
2.1.1 混合對照品溶液制備精密吸取銅、砷、鉛、鎘混合元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,用5%硝酸溶液制成1 μg/mL 的混合溶液;精密吸取汞單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,用5%硝酸溶液制成0.1 μg/mL 的溶液。
2.1.2 供試品溶液制備取本品適量,研細(xì)(過四號篩),精密稱取0.2 g,精密加入人工腸液[按中國藥典2020 年版四部通則8004 磷酸鹽緩沖液(含胰酶)(pH6.8)制備]25 mL,置37 ℃水浴中超聲處理(功率:500 W,頻率:40 kHz)2 h,搖勻,離心5 min(速度:4 000 r/min),取上清液,即得。取相同體積的人工腸液,同法制備樣品空白溶液。
2.1.3 內(nèi)標(biāo)溶液制備精密吸取鋰、鈧、鍺、銦、鉍混合內(nèi)標(biāo)儲備液適量,用5%硝酸溶液制成1 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。
在氦模式下進(jìn)行測定,使用調(diào)諧液調(diào)整儀器分辨率、靈敏度、氧化物、雙電荷等各項指標(biāo),使達(dá)到測定要求[6]。優(yōu)化參數(shù)見表1。
表1 儀器工作參數(shù)
測定時選取的同位素為63Cu、75As、114Cd、202Hg 和208Pb,其 中63Cu、75As 以72Ge 作為內(nèi)標(biāo),114Cd 以115In 作為內(nèi)標(biāo),202Hg、208Pb 以209Bi 作為內(nèi)標(biāo)。儀器的內(nèi)標(biāo)進(jìn)樣管在儀器分析工作過程中始終插入內(nèi)標(biāo)溶液中,依次將儀器的樣品管插入各個濃度的對照溶液中進(jìn)行測定(濃度依次遞增),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將儀器的樣品管插入供試品溶液中,測定,取3 次讀數(shù)的平均值,扣除相應(yīng)的樣品空白后,從標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得相應(yīng)的濃度。
精密吸取銅、砷、鉛、鎘混合元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 μg/mL)0、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL,分別置50 mL 量瓶中,加5%硝酸溶液制成系列混合對照品溶液。精密吸取汞單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.4、0.8、1.2、1.5、2.0 mL,分別置100 mL 量瓶中,加5%硝酸溶液制成系列對照品溶液。橫坐標(biāo)(x)為對照品濃度,縱坐標(biāo)(y)為3 次讀數(shù)的平均測量值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并平行測定樣品空白溶液11 次,計算該方法對樣品中各元素的檢出限。結(jié)果見表2。
表2 5種重金屬元素線性范圍及檢出限
取4 種混合元素溶液(40 ng/mL)和汞單元素溶液(1.2 ng/mL),分別進(jìn)樣測定6 次,結(jié)果測得銅、砷、鉛、鎘、汞濃度RSD 分別為0.8%、1.7%、1.1%、1.5%、1.8%,表明儀器的精密度良好。
取銅、砷、鉛、鎘混合對照品溶液(40 ng/mL)和汞對照溶液(1.2 ng/mL),每間隔一定時間(0、6、12、18、24 h)測定濃度,結(jié)果銅、砷、鉛、鎘、汞濃度RSD 分別為0.9%、1.5%、1.0%、1.6%、1.4%,表明待測元素在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。
采用人發(fā)國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW09101)作為參考,考察方法的準(zhǔn)確度,結(jié)果見表3。結(jié)果表明測定值與參考值基本相符,該方法準(zhǔn)確可靠。
表3 準(zhǔn)確度試驗結(jié)果(μg/g)
采用上述方法對22 批大七厘制劑中5 種可溶性重金屬元素進(jìn)行含量測定,結(jié)果見表4。
表4 樣品中可溶性重金屬含量測定結(jié)果(μg/g)
目前國際上對含礦物類中成藥中重金屬的限量沒有明確的規(guī)定,因此,鉛參照香港中成藥注冊安全性要求(不得過179 μg/d),砷參照美國重金屬允許攝入量的要求(不得過130 μg/d),銅、鎘、汞參照中藥注射劑中重金屬及有害元素殘留量檢查指導(dǎo)原則(銅不得過150 μg/d,鎘不得過3 μg/d,汞不得過2 μg/d)以及口服制劑的重金屬限度為注射劑的三倍(銅不得過450 μg/d,鎘不得過9 μg/d,汞不得過6 μg/d)的要求,再根據(jù)大七厘制劑的用法用量計算各品種的推薦限量,結(jié)果見表5。按此標(biāo)準(zhǔn)判定,1 批大七厘片砷含量超過限量,其他樣品均未超過限量。
表5 大七厘制劑中可溶性重金屬推薦限量
本文建立了ICP-MS 法測定在模擬人體環(huán)境下可溶解于人工腸液中的重金屬。經(jīng)分析探索研究后,最終模擬體內(nèi)的吸收過程,建立極限量法(最大量法)來測定可溶性重金屬,通過采用人工腸液、較為激烈的提取方法,來保證所提取的可溶性重金屬是在模擬人體環(huán)境下的極限值,避免因試驗參數(shù)無法完全復(fù)制而造成重現(xiàn)性差的問題;同時因人體能吸收的可溶性重金屬的量遠(yuǎn)小于極限值,可避免病理、生理、人種、年齡、性別等帶來的不確定性,達(dá)到安全化控制最大化。樣品的粒徑對測定結(jié)果有影響,研細(xì)過四號篩的粉末測定效果最好。
從樣品檢測結(jié)果來看,大七厘不同劑型和同劑型不同批次之間可溶性重金屬含量有差異,可能與投入生產(chǎn)的原料有關(guān)。1 批大七厘片砷含量超過限量,而未加自然銅的大七厘片中重金屬含量顯著降低,提示自然銅是造成重金屬偏高的主要原因。自然銅在入藥前需經(jīng)煅制,煅后重金屬含量顯著降低[8]。如企業(yè)使用煅制不充分或未煅制的自然銅投料,則可能造成含自然銅中成藥中重金屬含量偏高[9]。因此,控制好原料尤其是自然銅的質(zhì)量,可有效降低成品中重金屬的含量。
研究表明,可溶性重金屬含量遠(yuǎn)低于總重金屬含量[10-12],說明經(jīng)人體胃腸液消化后大部分重金屬元素被排出了體外,只有被人體吸收的重金屬才具有毒性作用[13]。因此,不能單純以重金屬總量作為毒性限度指標(biāo),建議將可溶性重金屬作為含礦物中成藥的質(zhì)控指標(biāo)之一,制訂合適的限量標(biāo)準(zhǔn)[14-15]。同時應(yīng)考察重金屬的生物溶出度及形態(tài)價態(tài)[16],為科學(xué)全面評價重金屬的毒性提供數(shù)據(jù)支撐。