韋曉虹，楊小穎，胡芳，梁藹明，郭一帆，孫遼

1.中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣東 珠海 519000；2.廣州市第一人民醫(yī)院，廣東 廣州 518000

非酒精性脂肪肝?。╪onalcoholic fatty liver disease,NAFLD）是除去酒精因素，其他原因?qū)е轮驹诟渭?xì)胞內(nèi)過度沉積為主要病理特征的臨床綜合征。據(jù)估計，全球NAFLD 患病率約25%［1］，2016 年中國NAFLD 估計總病例數(shù)為2.43 億［2］，現(xiàn)已取代慢性乙型肝炎成為第一大慢性肝臟疾病。未經(jīng)有效治療的NAFLD 易于從單純性脂肪變性逐漸演變?yōu)榉蔷凭灾靖窝?、肝纖維化以及肝硬化，甚至發(fā)展至肝癌［3］。此外，NAFLD 也是2 型糖尿病等代謝性疾病的獨立危險因素［4］。然而，除了生活方式干預(yù)外，目前尚無NAFLD 的有效治療藥物。深入探究NAFLD發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)靶點及其藥物開發(fā)，是防治NAFLD 亟待解決的問題。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）作為細(xì)胞“能量感受器”，在NAFLD的發(fā)病和進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用，通過介導(dǎo)脂質(zhì)合成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激、脂肪酸氧化等途徑改善肝臟脂肪變性［5-7］。這些效應(yīng)使得AMPK 成為NAFLD的潛在治療靶點。因此尋找安全有效的AMPK 激活劑是目前NAFLD 治療中的研究焦點之一。

黃芪甲苷（astragaloside Ⅳ，AS-Ⅳ）是從我國傳統(tǒng)中藥黃芪中提取的有效單體活性成分，有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗纖維化、降糖、調(diào)脂、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用［8］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：AS-Ⅳ能通過活化AMPK，減少肝細(xì)胞脂質(zhì)從頭合成和改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而減輕游離脂肪酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積［9］，在高脂高糖飲食誘導(dǎo)的NAFLD 小鼠模型中同樣觀察到AS-Ⅳ能改善肝臟脂質(zhì)沉積［10］。但AS-Ⅳ是否通過激活A(yù)MPK 在體內(nèi)發(fā)揮作用尚未清楚。因此，本研究通過高脂高糖飲食構(gòu)建NAFLD小鼠模型，探討AS-Ⅳ是否通過AMPK 發(fā)揮對NAFLD 小鼠肝臟脂質(zhì)沉積的改善作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物SPF 級5 周齡雄性C57BL/6 小鼠24只，購自廣東省醫(yī)學(xué)動物實驗中心（合格證編號為：NO.44007200044791），飼養(yǎng)于中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院實驗動物中心屏障環(huán)境［許可證號：SYXK（粵）2018-0188］，小鼠分籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，12 h光/暗周期交替，室溫22 ℃～26 ℃。動物實驗經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，編號為：中大五院［2016］倫字第（K59-1）號。

1.1.2 主要試劑與儀器高脂飼料（D12492）購于廣東省醫(yī)學(xué)動物實驗中心；標(biāo)準(zhǔn)普通飼料購自北京華阜康生物科技股份有限公司；AS-Ⅳ購自上海研瑾生物科技有限公司；1%羧甲基纖維素（CMC）、果糖和葡萄糖購自上海超研生物科技有限公司；伊紅染色液購自廣州華奇盛生物科技有限公司；蘇木素染色液購自biosharp；中性樹膠購自中國上海懿洋儀器有限公司；油紅O 染料購自廣州捷倍斯生物科技有限公司，甘油明膠購自北京索萊寶科技有限公司；PVDF 膜購自美國millipore 公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自南京凱基公司；p-AMPK、AMPK、β-actin、羊抗兔IgG抗體購自美國CST公司；3D 光交聯(lián)芯片購自美國Plexera Bioscience；高分辨率質(zhì)譜分析儀購自美國Thermo Scientific；肝細(xì)胞株（L02）購自廣州瓦盾生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 NAFLD 小鼠模型建立及干預(yù)5 周齡雄性C57BL/6小鼠標(biāo)準(zhǔn)普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)數(shù)字表法分為正常飲食組（CON）、高脂高糖飲食組（HFD）、高脂高糖飲食+AS-Ⅳ組（HFD+AS-Ⅳ），每組8 只。其中正常飲食：20%脂肪+60%蛋白質(zhì)+20%碳水化合物；高脂飲食主要包含60%脂肪+20%蛋白質(zhì)+20%碳水化合物；高糖飲食是以55%果糖、45%葡萄糖的比例配制成42 g/L。AS-Ⅳ用1%CMC 溶解后按60 mg·kg-1·d-1灌胃，連續(xù)13 周。實驗結(jié)束后采用1%戊巴比妥鈉麻醉，頸椎脫臼法處死小鼠，留取肝臟組織標(biāo)本。

1.2.2 HE 染色觀察肝臟組織切片新鮮肝臟組織用10%中性甲醛溶液固定24 h，梯度酒精常規(guī)脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋，連續(xù)切片（厚度4 μm），進(jìn)行HE 染色。切片常規(guī)經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化；蘇木素浸泡3 min，鹽酸酒精分化1 s，氨水返藍(lán)1 min，伊紅酒精浸染3 min，梯度酒精脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.3 油紅O 染色觀察肝臟組織切片新鮮肝臟組織用包埋劑包埋后置于-80 ℃冰箱保存，然后進(jìn)行連續(xù)切片（厚度10 μm），切片置于-20 ℃冰箱保存。染色時，肝臟冰凍切片室溫回溫，4%多聚甲醛固定10 min，蒸餾水浸洗，洗掉包埋劑；60%異丙醇浸洗2 min，便于著色；油紅O 工作液染色30 min 后，60%異丙醇調(diào)色20 s，蒸餾水浸洗，蘇木素復(fù)染30 s，鹽酸酒精分化1 s，蒸餾水浸洗2 次，甘油明膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.4 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測肝臟AMPK蛋白表達(dá)水平根據(jù)試劑盒說明書提取小鼠肝臟組織總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，取40 μg 蛋白樣品上樣進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，350 mA 恒流4 h 將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗（AMPK、p-AMPK、β-actin），4 ℃孵育過夜(至少12 h)，TBS 緩沖液洗膜，加入熒光二抗室溫避光孵育1 h，TBS 洗膜后，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描顯像并保持。使用Image-Pro Plus 軟件進(jìn)行灰度相對定量分析，以β-actin 作為內(nèi)參進(jìn)行校正，計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.5 高通量芯片技術(shù)篩選肝細(xì)胞中與AS-Ⅳ作用的潛在靶蛋白并模擬相互作用模式在肝細(xì)胞（L02）中加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行超聲破碎，4 ℃離心10 min后取上清保存?zhèn)溆?。將AS-Ⅳ固定到三維芯片表面,后放置于光交聯(lián)儀內(nèi)進(jìn)行光交聯(lián)反應(yīng)，每個孔加入100 μL 肝細(xì)胞裂解液，4 ℃過夜進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)；每孔加入80 μL 的 DTT，56 ℃孵育60 min，室溫冷卻；加入IAM 溶液至終濃度50 mmol/L 室溫暗處孵育45 min；加入等體積50 mmol/L NH4HCO3（pH=7.8），用1.5 mL 超濾管濃縮，重復(fù)4～5 次；采用BCA 試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度；取約100 μg 蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切：按Trypsin 酶與底物蛋白的量之比在1∶20～1∶100之間加入酶液，37 ℃孵育8 h～16 h；酶解液過C18柱，用2 mL 漂洗液洗滌2 次，用1 mL 洗脫液洗下樣本，收集，真空離心濃縮樣品。將分離后的肽段直接進(jìn)入質(zhì)譜儀Thermo Scientific Q Exactive 進(jìn)行檢測鑒定，質(zhì)譜原始文件經(jīng)過MaxQuant 搜庫（版本1.5.6.0）。最后利用SYBYL 軟件進(jìn)行分子模擬對接，模擬AS-Ⅳ與靶蛋白相互作用細(xì)節(jié)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 實驗結(jié)果

2.1 AS-Ⅳ改善高脂高糖飲食誘導(dǎo)的NAFLD 小鼠肝臟脂質(zhì)沉積

使用高脂高糖飲食構(gòu)建NAFLD 小鼠模型，同時給予AS-Ⅳ干預(yù)13 周。圖1A 顯示：與CON 組相比，HFD 組小鼠肝臟明顯增大，給予AS-Ⅳ干預(yù)后，NAFLD 小鼠的肝臟體積減??；HE 染色結(jié)果顯示HFD 組小鼠較CON 組小鼠肝臟脂滴形成明顯增多，而給予AS-Ⅳ干預(yù)后，肝臟脂滴形成明顯減少（圖1B）。油紅O 染色觀察到：與CON 組相比，HFD 組小鼠肝臟脂質(zhì)沉積增加，AS-Ⅳ干預(yù)可以減輕NAFLD 小鼠肝臟脂質(zhì)沉積（圖1C）。

圖1 AS-Ⅳ改善高脂高糖飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂質(zhì)沉積：A.小鼠肝臟大體照片；B.小鼠肝臟組織切片HE染色（光鏡×400）；C.小鼠肝臟組織切片油紅O染色（光鏡×400）

2.2 AS-Ⅳ上調(diào)高脂高糖誘導(dǎo)的NAFLD 小鼠肝臟AMPK 磷酸化水平

Western blot 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與CON 組相比，高脂高糖飲食誘導(dǎo)的NAFLD 小鼠肝臟p-AMPK 及AMPK 水平降低（P<0.01）；給予AS-Ⅳ干預(yù)后，p-AMPK 及AMPK 的蛋白水平上調(diào)（P<0.01），見圖2。

圖2 AS-Ⅳ上調(diào)高脂高糖誘導(dǎo)的 NAFLD小鼠肝臟AMPK磷酸化水平：A.小鼠肝臟組織蛋白Western blot檢測；B.對圖A的定量分析

2.3 AS-Ⅳ與AMPK-α 亞基直接結(jié)合

高通量芯片技術(shù)結(jié)果顯示：肝細(xì)胞中AMPKα1是AS-Ⅳ作用潛在靶蛋白（表1）；進(jìn)一步分子對接模擬顯示：潛在AS-Ⅳ結(jié)合位點位于自抑制多肽片段與AMPKα 亞基組成的口袋中（圖3C），且有別于目前已知的激動劑結(jié)合位點（圖3A）和核苷酸結(jié)合位點（圖3B）。

圖3 潛在AS-Ⅳ結(jié)合位點在AMPK全酶中的位置

表1 肝細(xì)胞（L02）中與AS-Ⅳ作用的靶蛋白

3 討論

非酒精性脂肪肝病是一種嚴(yán)重危害人類健康的代謝性疾病，目前缺乏有效的藥物治療手段。本研究以C57BL/6 小鼠為研究對象，通過高脂高糖飲食構(gòu)建NAFLD 小鼠模型，觀察到AS-Ⅳ可以減輕NAFLD 小鼠的肝臟脂質(zhì)沉積，同時上調(diào)AMPK磷酸化水平，這與本課題組已發(fā)表文章以及他人研究結(jié)果一致［10-11］。我們前期在游離脂肪酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞和小鼠原代肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積模型中發(fā)現(xiàn)：AS-Ⅳ通過激活A(yù)MPK 上調(diào)肝臟脂質(zhì)從頭合成限速酶乙酰輔酶A 羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c）的磷酸化水平，抑制SREBP-1c 核內(nèi)轉(zhuǎn)移，下調(diào)脂質(zhì)合成基因的mRNA 水平，抑制肝臟脂質(zhì)從頭合成，并能降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)水平從而改善肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積［9］。另外，已有的研究證明AMPK 還能介導(dǎo)氧化應(yīng)激、炎癥、脂肪酸氧化等改善肝臟脂肪變性［7］。AS-Ⅳ通過激活A(yù)MPK 途徑有望成為NAFLD 的有效治療藥物。

AMPK 是一種異源三聚體蛋白，由高度保守的α、β 和γ 3 個亞單位組成；其中α 亞單位是起催化作用的核心部位，存在2 種基因所編碼的異構(gòu)體（α1/α2），其中α1 在細(xì)胞中廣泛存在［12］。α 亞單位通過激酶區(qū)域內(nèi)蘇氨酸172（Thr172）的磷酸化，或通過自抑制區(qū)域（auto inhibitory area,AID）延緩Thr172 的去磷酸化激活A(yù)MPK［13］。AMPK 的激活方式有直接和間接兩種方式。AMPK間接激動劑如：二甲雙胍、噻唑烷二酮、姜黃素、白藜蘆醇等，主要通過升高AMP/ATP 和（或）ADP/ATP 比值，間接激活A(yù)MPK，但其改善代謝的作用是否特異依賴于AMPK 的活化，難以界定［14］。因此AMPK 直接激動劑相對間接激動劑具有更好的特異性，更具藥物開發(fā)潛質(zhì)。

目前，針對不同AMPK 亞型的直接激動劑研究取得了一定進(jìn)展，如直接結(jié)合于AMPK γ 亞基的阿卡地新（AICAR），可以激活不同組織的AMPK,調(diào)節(jié)糖代謝（Merck＆Co.公司）；直接結(jié)合于AMPKβ 亞基的A-769662，可以降低ob/ob 小鼠血糖和肝臟三酰甘油水平。此外，GSK 公司、Pfizer公司分別開發(fā)了吡咯并吡啶酮類及吲哚酸類AMPK直接激活劑。然后在研的AMPK 直接激活劑普遍存在生物利用度低、激動效率低及副作用大等缺陷，直接影響其臨床應(yīng)用前景［14］。AS-Ⅳ是中草藥黃芪中提取的有效單體活性成分，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式與現(xiàn)發(fā)現(xiàn)的AMPK 激活分子以及核苷酸均不同［15］。本研究發(fā)現(xiàn)AS-Ⅳ可以與AMPKα1 直接結(jié)合，進(jìn)一步分子對接模擬結(jié)果顯示：AS-Ⅳ相互作用區(qū)域位于AMPKα 亞基的自抑制多肽片段位置，有別于已知的底物或激活分子。因此AS-Ⅳ與AMPK 的結(jié)合模式有可能成為新型AMPK 活性調(diào)節(jié)模式。后續(xù)進(jìn)一步深入研究AS-Ⅳ激活A(yù)MPK 的分子機(jī)制及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，為后期改建或優(yōu)化直接活化AMPK 的AS-Ⅳ衍生物提供科學(xué)依據(jù)，不僅為開發(fā)NAFLD治療藥物提供新的線索，同時為開發(fā)中藥單體治療藥物研究提供有益的借鑒和研究策略。

4 結(jié)論

本研究通過高脂高糖飲食構(gòu)建NAFLD 小鼠模型，發(fā)現(xiàn)AS-Ⅳ能改善NAFLD 小鼠的肝臟脂質(zhì)沉積，且這一作用可能與直接激活A(yù)MPK 有關(guān)，但更具體的機(jī)制有待進(jìn)一步證實，從而為AS-Ⅳ治療NAFLD 提供理論依據(jù)。