常炳程,何蔚,夏志鴻
貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,貴州 貴陽(yáng) 550003
臨床治療后腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā),是三陰乳腺癌的患者預(yù)后不良的首要原因[1-3]。近年來,各種天然中草藥活性成分正成為國(guó)內(nèi)腫瘤藥物開發(fā)的熱點(diǎn)。木犀草素(luteolin,LUT),是一種提取自中草藥的黃酮類化合物,不僅具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗菌、解痙等多重藥理活性,同時(shí)對(duì)多種腫瘤的耐藥和轉(zhuǎn)移均有強(qiáng)效抑制作用,在三陰乳腺癌的治療方面極具潛力[4-8]。然而,木犀草素在水溶液中溶解度與藥劑溶出速率極低,且在胃腸道中易被微生物降解,難以通過口服吸收的方式遞送至腫瘤組織發(fā)揮療效[8-10]。由此可見,我們急需開發(fā)一種能高效運(yùn)載木犀草素到達(dá)病灶部位發(fā)揮藥理活性的藥物遞送體系。
聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic acidglycolic acid),PLGA]是一種應(yīng)用廣泛的藥用輔料,其能夠在人體內(nèi)完全降解為無害的乳酸小分子,生物相容性極好[11]。本研究采用單乳法制備了一種可高效包封木犀草素的納米粒(PLGA-NPs@DOX/LUT),并同時(shí)搭載了模式化療藥物阿霉素(doxorubicin,DOX)與其配伍,研究其對(duì)三陰乳腺癌轉(zhuǎn)移的治療作用。
PLGA(羧基末端,50∶50,分子量24 000~38 000),PVA(聚乙烯醇;醇解度:98.0~99.0 mol%,黏度:5.2~6.0 mPa.s);木犀草素、N,N-二甲基甲酰胺、甘露醇等化學(xué)試劑均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;鹽酸阿霉素購(gòu)自武漢卡諾斯科技有限公司;MBA-MD-231 三陰乳腺癌細(xì)胞系來源于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)昆明細(xì)胞庫(kù);MTT 試劑盒與細(xì)胞培養(yǎng)生化試劑均采購(gòu)來白鯊公司。
800 目銅碳網(wǎng)購(gòu)自中鏡科儀;萊恩德全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀;日立CF-RN 冷凍高速離心機(jī);奧林巴斯CKX53 倒置相差顯微鏡;Elma P300H 超聲波清洗儀;Nano S90 激光粒度儀(英國(guó)馬爾文公司)Agilent 1200 型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent 公司);Avestin LF-1 脂質(zhì)體擠出器;賽默飛Forma310/311 二氧化碳培養(yǎng)箱;Corning 公司24 孔板Transwell 3422,8 μm。
首先將PLGA 3.5 mg,LUT 0.8 mg,脫鹽后的DOX 1 mg,溶解于3 mL 體積比為2∶1 氯仿/乙醇混合溶液中待用。配制6 mL 濃度5 %的PVA水溶液,并將上述PLGA 混合溶液用針頭在超聲波清洗儀中逐滴加入,繼續(xù)超聲5 min 后,將所有溶液轉(zhuǎn)移至小燒瓶中,并同時(shí)加入0.5 % PVA溶液15 mL,敞口揮發(fā)有機(jī)溶液,磁力攪拌過夜,轉(zhuǎn)速1 000 rpm。12 h 后,收集所有溶液,短暫超聲分離后低速離心5 min(3 000 r/min)除去大顆粒。接著高速離心30 min(18 000 r/min),收集沉淀并重新分散保存于甘露醇水溶液中,最終利用脂質(zhì)體擠出器過膜0.4 μm,得到納米粒PLGA@DOX/LUT。
對(duì)照組單藥納米粒與無藥納米粒PLGA-NPs@DOX、PLGA-NPs@LUT、PLGA-NPs 均僅在原料中省去對(duì)應(yīng)成分并采用相同方法構(gòu)建。
所有藥物合成材料與環(huán)境均經(jīng)過無菌過濾處理,而且納米藥物在進(jìn)入細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前需利用0.4 μm濾膜除菌后使用。
電鏡拍攝:取納米粒純水分散液數(shù)滴置于800 目銅碳網(wǎng)上,室溫晾干后用磷鎢酸負(fù)染液(0.2%)染色5 min,再用蒸餾水再次潤(rùn)濕后自然干燥。最后將標(biāo)本寄送至三方電鏡檢測(cè)平臺(tái)送測(cè)。掃描電鏡直接取標(biāo)本凍干粉末寄送;激光粒度儀檢驗(yàn):取納米粒0.1 mg 超聲分散于3 mL PBS 溶液中,直接使用電勢(shì)粒度專用池子探頭進(jìn)行檢驗(yàn);體外穩(wěn)定性測(cè)試:取納米粒0.1 mg 超聲分散于3 mL PBS 溶液中,分別在既定時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)其粒徑變化;載藥量測(cè)試:取納米粒1 mg 溶解于20 mL 的氯仿/乙腈(3∶1)混合溶液中,充分過濾后,旋干后使用展開劑復(fù)溶,利用HPLC檢測(cè)其中木犀草素與阿霉素含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線使用購(gòu)買的原料藥倍比稀釋配制而成。計(jì)算公式:載藥量=(溶出藥物質(zhì)量/所溶解的總納米粒質(zhì)量)×100%。
取納米粒1 mg 分散于pH 7.4 的PBS 或者pH 5.0的醋酸鹽緩沖液中,置于恒溫箱(37 ℃)震蕩;按預(yù)設(shè)時(shí)間定時(shí)取出分散液,離心分離上清待測(cè),并重新加入等量新鮮緩沖液,并重復(fù)此操作;最后將不同時(shí)間點(diǎn)的待測(cè)上清溶液凍干后,用以上HPLC流動(dòng)相復(fù)溶并檢測(cè),計(jì)算每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的累計(jì)藥物釋放量并繪圖。
細(xì)胞采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)擴(kuò)增后,將消化分散后的MDA-MB-231細(xì)胞分別按4 000 個(gè)細(xì)胞每孔的濃度,鋪入96 孔板。24 h 后,將每孔原有培養(yǎng)基更換為含有梯度濃度(倍比稀釋阿霉素濃度:5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25 μg/mL)的游離阿霉素DOX、PLGA-NPs@DOX/LUT、PLGA-NPs@DOX、PLGA-NPs@LUT、PLGA-NPs 或PBS 的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,接著更換含有MTT 的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 h。小心吸去上清后,加入DMSO 溶解紫色結(jié)晶并使用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 處吸光度。
細(xì)胞遷移:將游離DOX/LUT、PLGA-NPs@DOX/LUT、DOX、DOX 0.02 mg/mL 或PBS 混入無血清培養(yǎng)基,并且取8 000 個(gè)MDA-MB-231 細(xì)胞分散至150 μL 無血清培養(yǎng)基中,滴入Transwell 小室薄膜上層,然后將小室放置于小孔中,并在小孔下層加入1 mL 無血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后,取出Transwell 小室,抹去薄膜上層細(xì)胞,多聚甲醛固定細(xì)胞后,用0.1%結(jié)晶紫染色2 min 后,觀察下層遷移過薄膜的細(xì)胞。
細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)在加入細(xì)胞前需要先在小室上層鋪入50 μL11% BD Matrigel 基質(zhì)膠。后續(xù)與細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)一致,但培養(yǎng)時(shí)間需延長(zhǎng)至48 h 后再染色觀測(cè)。
項(xiàng)目數(shù)據(jù)使用SPSS 軟件分析。數(shù)據(jù)均采用t檢驗(yàn)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差別,每一項(xiàng)數(shù)據(jù)的收集n=3。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
首先通過透射電鏡觀察,PLGA-NPs@DOX/LUT 納米粒呈規(guī)則圓球形,分散狀態(tài)良好,未發(fā)現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象(見圖1);結(jié)合激光粒度儀的動(dòng)態(tài)光散射數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)納米粒水合粒徑約為114.8 nm,表面電勢(shì)為(-15.46 mV);而且通過溶液萃取納米粒,并利用高效液相色譜分析可知,其實(shí)現(xiàn)了難溶性天然中草藥組分木犀草素與阿霉素的高效包封,對(duì)阿霉素載藥量為18.11 %,木犀草素10.15 %,分散性與表面電勢(shì)也基本符合課題設(shè)計(jì)要求(見表1)。
圖1 納米粒PLGA-NPs@DOX/LUT的電鏡照片:
此外,動(dòng)態(tài)光散射數(shù)據(jù)顯示,對(duì)照給藥組PLGA-NPs@DOX、PLGA-NPs@LUT、PLGA-NPs 粒徑與實(shí)驗(yàn)組尺寸相似,粒徑均為120 nm 左右,載藥量差異不大(見表1)。
表1 納米粒動(dòng)態(tài)光散射檢測(cè)數(shù)據(jù)與載藥量()
表1 納米粒動(dòng)態(tài)光散射檢測(cè)數(shù)據(jù)與載藥量()
首先,通過體外穩(wěn)定性測(cè)試實(shí)驗(yàn)可見,PLGANPs@DOX/LUT 在含有10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基環(huán)境下結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定,粒徑在32 h 內(nèi)變化不明顯,見圖2A。
圖2 納米粒PLGA-NPs@DOX/LUT藥物穩(wěn)定性測(cè)試與藥物釋放曲線:A.體外穩(wěn)定性測(cè)試;B.藥物釋放曲線
通過藥物釋放實(shí)驗(yàn)可見,納米粒中包封的藥物在中性環(huán)境下藥物釋放緩慢,而當(dāng)我們利用微酸緩沖液模擬腫瘤微環(huán)境時(shí)發(fā)現(xiàn)木犀草素在72 h內(nèi)均勻緩釋,阿霉素釋放相對(duì)較快48 h 內(nèi)就釋放超過80%,最終實(shí)現(xiàn)了兩種封裝藥物的共同釋放,見圖2B。
為了評(píng)價(jià)PLGA-NPs@DOX/LUT 對(duì)于三陰乳腺癌細(xì)胞的抑制效果,我們選用了MBA-MD-231 細(xì)胞通過MTT 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)試。在相同藥物濃度條件下,可見PLGA-NPs@DOX/LUT 的加入明顯比單藥納米組PLGA-NPs@DOX、PLGA-NPs@LUT 對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性更強(qiáng)(見圖3)。經(jīng)過計(jì)算,同樣可知PLGA-NPs@DOX/LUT 中阿霉素的IC50 僅為0.628 μg/mL,遠(yuǎn)低于單藥組納米粒(PLGA-NPs@DOX 3.475 μg/mL ;PLGA-NPs@LUT >5 μg/mL)。
圖3 納米粒PLGA-NPs@DOX/LUT的腫瘤細(xì)胞殺傷能力
為了在體外評(píng)價(jià)PLGA-NPs@DOX/LUT 對(duì)于三陰乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的抑制效果,我們利用了Transwell 細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。在相同藥物濃度的配比下,可見PLGA-NPs@DOX/LUT 能夠最大限度地降低三陰乳腺癌細(xì)胞的遷移能力與侵襲能力,與傳統(tǒng)化療組游離DOX組對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(見圖4)。
圖4 納米粒PLGA-NPs@DOX/LUT對(duì)三陰乳腺癌細(xì)胞的遷移與侵襲抑制能力:A細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)與統(tǒng)計(jì)結(jié)果;B細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)與統(tǒng)計(jì)結(jié)果
在近幾十年的發(fā)展中,納米藥物遞送系統(tǒng)得到飛速的發(fā)展,然而我國(guó)傳統(tǒng)中草藥中天然組分的制劑研究卻還遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后,難以滿足當(dāng)前中草藥制劑現(xiàn)代化改革的需求。本課題組從貴州本省道地藥材白毛夏枯草的調(diào)研中發(fā)現(xiàn),其主要抗癌活性成分木犀草素具有抗腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、抗炎和免疫調(diào)節(jié)多種藥理作用[7,12-14]。但受制于其溶解性差、口服給藥效率極低的問題,嚴(yán)重制約了其在臨床一線的應(yīng)用[15]。
本研究將木犀草素與模式抗癌藥物阿霉素共同封裝于PLGA 納米顆粒之中,初步地解決了傳統(tǒng)中草藥活性成分藥物遞送效率較低的問題。通過三陰乳腺癌的細(xì)胞殺傷性實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞遷移侵襲實(shí)驗(yàn)證明,納米藥物遞送系統(tǒng)能夠有效實(shí)現(xiàn)木犀草素的有效包封,使其與化療藥物形成協(xié)同抗癌效應(yīng),有希望緩解三陰乳腺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。然而,本研究?jī)H實(shí)現(xiàn)了納米藥物遞送系統(tǒng)的初步構(gòu)建與體外藥效驗(yàn)證,其在體內(nèi)的有效性以及靶向藥物遞送效率尚有待考察,今后還需進(jìn)一步研究。