程絲，許喆，左穎婷，劉陽，王安心，石延楓，李昊，王擁軍

研究遺傳因素對卒中結(jié)局的影響，對于了解疾病發(fā)生進(jìn)展及探索潛在的卒中治療靶點至關(guān)重要[1]。多項研究表明，鋅指同源框3（zinc finger homeobox 3，ZFHX3）基因單核苷酸變異（single nucleotide variant，SNV）的3個位點（rs7193343[2-3]、rs879324[4]和rs12932445[5]）不同基因型與心源性栓塞型（cardioembolic，CE）卒中的發(fā)生風(fēng)險有關(guān)，也有研究表明rs7193343基因型與心房顫動有關(guān)[6-7]。但是，ZFHX3基因是否參與了卒中的發(fā)生發(fā)展，以及其遺傳變異是否與卒中預(yù)后存在關(guān)聯(lián)尚無研究報道。因此，本研究針對來自中國國家卒中登記研究Ⅲ（third China national stroke registry，CNSR-Ⅲ）[8]中首次發(fā)生缺血性卒中或TIA的患者，分析ZFHX3基因上3個變異位點與卒中預(yù)后及相關(guān)危險因素之間的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 CNSR-Ⅲ是全國多中心的前瞻性登記研究[8]，自2015年8月-2018年3月連續(xù)納入15 166例急性缺血性卒中（14 146例）或TIA（1020例）患者（入組標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲；缺血性卒中或者TIA患者；發(fā)病至入組時間≤7 d），研究對象覆蓋全國22個省和4個直轄市的201所醫(yī)院。其中，12 603例患者參與了預(yù)先設(shè)計的遺傳亞組研究。研究獲得首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號：KY2015-001-01），患者或家屬均簽署知情同意書。

本研究納入標(biāo)準(zhǔn)：①CNSR-Ⅲ中參與了預(yù)先設(shè)計的遺傳亞組研究的急性缺血性卒中或TIA患者；②既往無卒中病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者提供的血液樣本中DNA含量或質(zhì)量不符合基因檢測要求；②基因分型成功率≤66%；③卒中病因?qū)W分類系統(tǒng)（causative classification of stroke，CCS）分型為其他原因型卒中。

1.2 基線信息收集 通過研究數(shù)據(jù)庫收集患者的基線資料。①人口學(xué)信息：年齡、性別、BMI；②病史：心房顫動、高血壓、冠心病、糖尿病、血脂異常；③臨床相關(guān)信息：入院時NIHSS評分、CCS分型。

高血壓定義為收縮壓≥140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）或舒張壓≥90 mm Hg，或使用任何降壓藥物及患者自述的高血壓病史；糖尿病定義為住院期間或入院時空腹血糖≥7.0 mmol/L，或使用降血糖藥物及醫(yī)師診斷的糖尿病病史；血脂異常、心房顫動和冠心病定義為患者自述或醫(yī)師診斷疾病史，或住院期間被醫(yī)師診斷為此疾病。

采用CCS對患者進(jìn)行卒中病因?qū)W分型[9]：大動脈粥樣硬化型（large-artery atherosclerotic，LAA）、CE、小動脈閉塞型（small artery occlusion，SAO）及原因未明型（undetermined causes，UC）。

1.3 卒中結(jié)局 對患者發(fā)病后1年內(nèi)隨訪3次（發(fā)病3個月和1年時采用面對面隨訪，發(fā)病6個月時采用電話隨訪）。從CNSR-Ⅲ數(shù)據(jù)庫中采集患者卒中復(fù)發(fā)和聯(lián)合血管事件發(fā)生的信息，未住院患者的疑似事件由臨床終點事件判定委員會獨立評估。卒中復(fù)發(fā)定義為1年隨訪期間，患者再次發(fā)生缺血性卒中或出血性卒中；聯(lián)合血管事件包括1年隨訪期間內(nèi)發(fā)生的缺血性卒中、出血性卒中、心肌梗死及血管性死亡事件；不良功能結(jié)局定義為1年隨訪時mRS＞2分。

1.4 基因分型與質(zhì)量控制 采用競爭性等位基因特異性PCR技術(shù)（kompetitive allele specific PCR，KASP）[10]對3個SNV rs7193343、rs879324和rs12932445進(jìn)行基因分型。為保證基因分型的準(zhǔn)確性，在隨機(jī)選擇的10例患者DNA中，采用KASP和Sanger測序兩種技術(shù)分別檢測3個SNV位點，兩種方法之間的一致性為100%。排除基因分型成功率（成功基因分型的SNV數(shù)目/3）≤66%的患者，要求每個SNV位點的成功檢出率（成功基因分型的患者數(shù)/7674）＞95%，本研究沒有進(jìn)行基因型填補(bǔ)。

1.5 數(shù)據(jù)分析 分別在納入總體人群、各CCS亞型人群中進(jìn)行SNV位點與基線特征的關(guān)聯(lián)分析及SNV位點與卒中結(jié)局（1年卒中復(fù)發(fā)、聯(lián)合血管事件和不良功能結(jié)局）的關(guān)聯(lián)分析，另外，進(jìn)行SNV的基因型與CCS亞型的交互作用分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SAS 9.4軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料用表示，偏態(tài)分布的計量資料以M（P25～P75）表示，計數(shù)資料以率（%）表示。以3個SNV位點基因型為自變量，以所有基線指標(biāo)為因變量，進(jìn)行SNV位點與基線特征的關(guān)聯(lián)分析。當(dāng)因變量為計量資料時，采用多重線性回歸分析；當(dāng)因變量為計數(shù)資料時，采用邏輯回歸分析。對SNV位點與卒中結(jié)局的關(guān)聯(lián)分析，自變量為3個SNV位點基因型，因變量為卒中結(jié)局（1年隨訪期間卒中復(fù)發(fā)、聯(lián)合血管事件及不良功能結(jié)局）。分析SNV位點與卒中復(fù)發(fā)和聯(lián)合血管事件的關(guān)聯(lián)性時，將發(fā)病至事件發(fā)生的時間間隔納入統(tǒng)計模型，年齡、性別和心房顫動作為協(xié)變量，采用Cox回歸分析；分析SNV位點與1年不良功能結(jié)局的關(guān)聯(lián)性時，將年齡、性別、心房顫動、入院NIHSS評分和聯(lián)合血管事件作為協(xié)變量進(jìn)行校正，采用邏輯回歸分析。SNV的基因型與CCS亞型的交互作用分析，兩者的交互為相乘模型。進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析和交互作用分析時，只有當(dāng)相應(yīng)患者的SNV基因型和表型數(shù)據(jù)同時不為缺失值時，才將該患者數(shù)據(jù)納入分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.7 生物信息學(xué)方法 應(yīng)用HaploView 4.2軟件計算3個SNV位點的相關(guān)系數(shù)R2值[11]，分析3個SNV位點之間的連鎖不平衡情況。采用PLINK 1.9軟件計算每個位點的哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）情況。為比較3個SNV位點在不同族裔人群中的頻率，非中國人群中的等位基因頻率檢索并計算于千人基因組數(shù)據(jù)庫[12]。

2 結(jié)果

2.1 患者基線特征 最終7674例患者符合納入與排除標(biāo)準(zhǔn)納入本研究（圖1）?？傮w患者中，平均年齡61.7±11.5歲，女性2438例（31.77%）。其中665例（8.67%）患者在1年隨訪期間內(nèi)卒中復(fù)發(fā)，703例（9.16%）患者發(fā)生聯(lián)合血管事件，829例（10.80%）患者在1年隨訪時mRS＞2分。

圖1 本研究納入患者的流程圖

2.2 基因型人群頻率 本研究人群中3個SNV位點的風(fēng)險等位基因頻率與千人基因組數(shù)據(jù)庫中非亞裔的風(fēng)險等位基因頻率不同，這3個SNV位點的風(fēng)險等位基因頻率在中國人群中（CNSR-Ⅲ，北方漢族/南方漢族）高于歐洲人群、混合美國人群及非洲人群，且在CE卒中患者中風(fēng)險等位基因頻率最高（表1）。

表1 本研究患者與其他人群中ZFHX3基因上3個SNV位點的風(fēng)險等位基因頻率比較

2.3 SNV變異位點基因型與基線特征的關(guān)聯(lián)分析 在進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析時，按照加性模型轉(zhuǎn)換3個SNV位點的基因型，即將rs7193343位點的基因型CC、CT、TT定義為0、1、2，將rs12932445位點的基因型TT、TC、CC定義為0、1、2，將rs879324位點的基因型GG、GA、AA定義為0、1、2，SNV變異位點基因型與基線特征見表2。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，3個SNV位點中，rs879324和rs12932445位點處于高度連鎖不平衡狀態(tài)（相關(guān)系數(shù)R2=0.88），同時以上2個SNV位點與心房顫動、入院時NIHSS評分及卒中亞型有關(guān)聯(lián)；未發(fā)現(xiàn)3個SNV位點與BMI、高血壓、冠心病、糖尿病及血脂異常卒中危險因素有關(guān)聯(lián)（表3）。

表2 SNV變異位點基因型與基線特征

表3 SNV變異位點基因型與基線特征的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

2.4 卒中亞型中ZFHX3基因上3個SNV位點與卒中結(jié)局風(fēng)險的關(guān)聯(lián)分析 在不同卒中亞型中，3個SNV位點均與1年聯(lián)合血管事件有關(guān)聯(lián)，在校正年齡、性別及心房顫動協(xié)變量后相關(guān)性仍然顯著。在CE卒中亞型中，rs7193343位點的T等位基因與卒中復(fù)發(fā)和聯(lián)合血管事件的發(fā)生有關(guān)聯(lián)（校正HR1.92，95%CI1.21～3.05；校正HR1.95，95%CI1.26～3.01）；rs879324位點的A等位基因和rs12932445位點的C等位基因與聯(lián)合血管事件有關(guān)聯(lián)（校正HR1.58，95%CI1.10～2.27；校正HR1.66，95%CI1.16～2.38）。在UC卒中亞型中，rs7193343位點的T等位基因與卒中復(fù)發(fā)和聯(lián)合血管事件的發(fā)生有關(guān)聯(lián)（校正HR1.34，95%CI1.09～1.64；校正HR1.36，95%CI1.11～1.66）。校正年齡、性別、心房顫動、入院時NIHSS評分和聯(lián)合血管事件后，未發(fā)現(xiàn)3個SNV位點與不良功能結(jié)局之間存在關(guān)聯(lián)。在總體人群中，rs7193343位點的T等位基因與不良功能結(jié)局存在關(guān)聯(lián)（HR1.13，95%CI1.01～1.26），但校正年齡、性別、心房顫動、入院時NIHSS評分和聯(lián)合血管事件后，結(jié)果顯示3個SNV位點與卒中結(jié)局均不存在關(guān)聯(lián)（表4）。

表4 卒中亞型中ZFHX3基因上3個SNV位點與卒中結(jié)局風(fēng)險的關(guān)聯(lián)分析

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)ZFHX3基因上的3個SNV位點（rs7193343、rs879324和rs12932445）與卒中后的卒中復(fù)發(fā)和聯(lián)合血管事件結(jié)局存在一定關(guān)聯(lián)，且此關(guān)聯(lián)僅發(fā)生于CE和UC型卒中人群中。此外，未發(fā)現(xiàn)此3個SNV位點與不良功能結(jié)局存在關(guān)聯(lián)。該結(jié)果提示不同卒中亞型患者卒中結(jié)局的遺傳機(jī)制可能存在差異，且ZFHX3基因上3個SNV位點與卒中結(jié)局關(guān)聯(lián)性的機(jī)制，可能與心源性血管事件有關(guān)。

在本研究中，處于高度連鎖不平衡狀態(tài)的2個SNV（rs879324和rs12932445）曾被報道與CE型卒中的發(fā)生有關(guān)[4-5]，但未表明是否與心房顫動有關(guān)。本研究結(jié)果首次表明rs879324和rs12932445位點與心房顫動存在一定關(guān)聯(lián)性。此外，既往研究表明ZFHX3基因的rs7193343位點與心房顫動的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)[2-3，6-7]，但本研究結(jié)果顯示中國腦血管病人群rs7193343位點與心房顫動無關(guān)，該結(jié)果與既往對香港漢族人群中進(jìn)行的全基因組關(guān)聯(lián)分析研究結(jié)果一致（該研究包括286例心房顫動患者和2763名健康者；OR1.05，P=0.63），但與同一研究中的歐裔人群的結(jié)果不一致[2]，提示不同遺傳背景人群心房顫動的易感基因存在一定差異。本研究在校正心房顫動指標(biāo)后，結(jié)果顯示ZFHX3基因的SNV位點與卒中結(jié)局之間的關(guān)聯(lián)仍然存在，表明ZFHX3基因與卒中結(jié)局的關(guān)聯(lián)可能不僅是由心房顫動介導(dǎo)。除心房顫動因素外，本研究的3個SNV位點與患者BMI、高血壓、冠心病、糖尿病及血脂異常均無一定關(guān)聯(lián)，表明3個SNV位點與卒中結(jié)局之間的關(guān)聯(lián)可能不是通過這些表型介導(dǎo)的。

3個SNV位點均位于ZFHX3基因的第一個內(nèi)含子區(qū)。ZFHX3編碼一個名為AT結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)肌細(xì)胞和神經(jīng)元分化[13-15]，在人體組織中普遍表達(dá)，但表達(dá)水平較低[16]。既往研究尚未闡明其在卒中進(jìn)展中的作用[17-18]。rs879324和rs12932445位點位于增強(qiáng)子區(qū)域，而rs7193343位點位于絕緣子區(qū)域。rs879324和rs12932445位點與ZFHX3基因的表達(dá)數(shù)量性狀基因座位點[19]rs805781處于高度連鎖不平衡狀態(tài)（相關(guān)系數(shù)R2＞0.9）。rs7193343位點與卒中結(jié)局的關(guān)聯(lián)與rs12932445或rs879324位點無關(guān)，表明這些區(qū)域的功能存在差異。

綜上所述，本研究分析了ZFHX3基因上3個SNV位點（rs7193343、rs879324和rs12932445）與卒中結(jié)局及卒中相關(guān)危險因素之間的關(guān)聯(lián)，并首次發(fā)現(xiàn)了此3個SNV位點與卒中復(fù)發(fā)和聯(lián)合血管事件的關(guān)聯(lián)性，且該關(guān)聯(lián)具有卒中亞型特異性特點。未發(fā)現(xiàn)3個SNV位點與卒中發(fā)病1年后的不良功能結(jié)局有關(guān)。本研究還存在以下局限性：第一，本研究為關(guān)聯(lián)分析研究，關(guān)聯(lián)關(guān)系不能解釋因果關(guān)系。第二，卒中臨床結(jié)局由不同病因的事件組成，因此本研究所發(fā)現(xiàn)的ZFHX3基因上3個SNV位點與卒中結(jié)局關(guān)聯(lián)結(jié)果的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。第三，本研究是基于CNSR-Ⅲ的子隊列研究，其中患者主要來自城市環(huán)境，可能不代表整個中國卒中患者群體。

【點睛】本研究分析了ZFHX3基因上3個SNV位點（rs7193343、rs879324和rs12932445）與卒中結(jié)局及卒中相關(guān)危險因素之間的關(guān)聯(lián)，首次發(fā)現(xiàn)了此3個SNV位點與卒中復(fù)發(fā)和聯(lián)合血管事件的關(guān)聯(lián)性，且該關(guān)聯(lián)具有卒中亞型特異性特點。