陳青芳，趙順英，溫少紅，董雯，劉文倩，龔婷，陳文濤，劉向榮，王擁軍，2，3，4

缺血性卒中占卒中的70%以上[1]，其高致殘率嚴重威脅我國人民健康，并造成了重大的社會經濟壓力[2-3]。缺血性卒中后由于血管閉塞，遠端腦組織缺血缺氧，線粒體呼吸受抑制，組織炎癥反應增加，從而造成腦組織的損傷[4-6]。小膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)固有的免疫細胞，也是卒中后炎癥響應的關鍵細胞，其活化分為M1和M2兩種極化狀態(tài)[7]，通過促炎和抗炎的雙重作用影響著損傷區(qū)域腦組織炎性反應的發(fā)展[8-9]。

長春西汀是從小長春花中提取的一種生物堿，廣泛應用于腦血管、心血管和視網膜缺血性疾病的治療[10-11]?；A和臨床研究顯示，長春西汀可抑制缺血組織的炎性細胞浸潤，抑制內毒素誘導的腫瘤誘導因子、IL-1β的上調，并通過核因子κB/蛋白激酶B（nuclear factor kappa-B/protein kinase B，NF-κB/Akt）通路降低炎性因子的表達[12-15]。長春西汀能否改善永久性腦缺血后的炎性反應和神經功能損傷尚未見報道。本研究采用小鼠大腦中動脈遠端閉塞模型模擬腦局灶性永久性腦缺血，之后連續(xù)給予長春西汀注射液治療14 d，探究其在腦缺血后對神經功能的改善作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性C57BL/6J小鼠36只，體質量24±0.5 g，北京華阜康生物科技股份有限公司提供。在24±2 ℃，濕度55%±5%環(huán)境中適應性飼養(yǎng)1周后隨機分組，自由飲食飲水。本研究按照北京神經外科研究所動物房倫理實施（動物倫理批號：201904019）。

1.2 藥品與劑量 按照體表面積將長春西汀注射液（河南潤弘制藥股份有限公司，規(guī)格2 mL：10 mg，生產批號1810202）的成人每日給藥劑量（0.5 mg/kg，6 mL）等劑量換算為小鼠使用劑量（4.55 mg/kg，21.84 μL）參考藥物說明書用生理鹽水稀釋至150 μL。

1.3 模型制作與給藥 小鼠稱重后異氟烷麻醉，分離頸總動脈，右側俯臥位，暴露并磨透顱骨，暴露右側大腦中動脈遠端。本研究共分為4組：①永久性腦缺血組6只，高頻電刀凝斷右側大腦中動脈遠端，多普勒血流量儀監(jiān)測凝斷點遠心端無血流代表電凝成功，后續(xù)不進行任何藥物或生理鹽水處理；②生理鹽水組12只，凝斷右側大腦中動脈遠端20 min后第1次尾靜脈注射生理鹽水5 min，之后每日1次至14 d，每次注射150 μL；③長春西汀組12只，凝斷右側大腦中動脈遠端20 min后第1次尾靜脈注射長春西汀5 min，之后每日1次至14 d，每次注射稀釋后的長春西汀注射液150 μL（4.55 mg/kg）；④假手術組6只，僅暴露大腦中動脈遠端，不電凝不給藥。

1.4 神經功能與運動評價 模型成功后3 d、5 d、7 d、9 d、11 d和14 d分別進行改良加西亞神經功能評分和轉棒測試。改良加西亞神經功能評分包括軀體本體覺、胡須碰觸、肢體對稱性、側轉向和前肢行走5項，每項滿分3分，總分15分[16]。轉棒測試中，每只小鼠每天測試3次，每次間隔時間為15 min，避免小鼠疲勞。記錄每次訓練時小鼠在跑步機上的速度和時間，評價其神經功能。

1.5 組織免疫熒光染色 模型成功后14 d，生理鹽水組和長春西汀組各取7只小鼠，假手術組和永久性缺血組各取6只小鼠，處死后全腦冰凍切片。從前至后每隔1 mm選取20 μm厚的1片切片用神經元核抗體（NeuN抗體，Millipore，美國）染色，Vectra Polaris病理成像系統(tǒng)（Perkin-Elmer，美國）拍攝確定神經元損傷體積，用ImageJ軟件進行數(shù)據(jù)分析，每層神經元損傷體積=神經元損傷面積×層厚，總神經元損傷體積為每層神經元體積之和。

模型成功后14 d每組取3只小鼠，處死后全腦冰凍切片。用離子化鈣結合適配分子1抗體（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1，Abcam，英國）和CD16/32（BD biosciences，美國）或Iba1和CD206（R&D systems，美國）共染評價小膠質細胞表型轉化情況。Iba1和CD16/32陽性為M1型小膠質細胞，Iba1和CD206陽性為M2型小膠質細胞。用LSM710激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss AG，德國）進行數(shù)據(jù)采集，每只小鼠隨機選取3個梗死區(qū)周圍視野進行相對熒光定量分析。實驗流程圖如圖1。

圖1 實驗流程圖

1.6 統(tǒng)計方法 采用GraphPad Prism 8.0.2軟件進行統(tǒng)計，計量資料數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，表示為，多時間點重復測量的指標組間比較采用雙因素方差分析，單時間點的指標組間比較采用單因素方差分析，在整體差異有統(tǒng)計學意義的情況下進一步兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同時間神經功能評分 術后3 d、5 d、7 d、9 d、11 d和14 d評價小鼠改良加西亞評分，4組間軀體本體覺、胡須碰觸、肢體對稱性、側轉向和前肢行走5個分項評分及總分差異均有統(tǒng)計學意義（表1）。兩兩比較顯示，除3 d時的軀體本體覺、胡須碰觸和前肢行走評分外，永久性腦缺血組其余各時間點各分項評分及總評分均低于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義；生理鹽水組與假手術組相比，除3 d時的胡須碰觸評分、7 d和11 d時的肢體對稱性評分、11 d時的前肢行走評分差異無統(tǒng)計學意義外，其余時間點生理鹽水組各分項評分及總評分均低于假手術組，差異均有統(tǒng)計學意義，另外，生理鹽水組11 d時肢體對稱性評分還顯著高于永久性腦缺血組；長春西汀組3 d、7 d、9 d、11 d、14 d時軀體本體覺評分，3 d、7 d、11 d和14 d的肢體對稱性評分，3 d、7 d時胡須碰觸評分，各時間點側轉向評分，3 d、9 d時前肢行走評分及各時間點的總分均低于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義；長春西汀組7 d時軀體本體覺評分、11 d時側轉向評分、14 d時肢體對稱性評分、11 d和14 d時的總分均高于永久性腦缺血組，差異有統(tǒng)計學意義。

表1 術后各組小鼠不同時間改良加西亞評分表

2.2 轉棒運動測試 模型成功后各組小鼠轉棒運動測試在轉棒上停留的時間和運動速度整體差異有統(tǒng)計學意義（表2）。其中長春西汀組14 d的轉棒運動時間（P=0.024）和運動速度（P=0.019）比永久性腦缺血組顯著增加。

表2 術后各組小鼠不同時間轉棒測試表

2.3 神經元損傷 模型成功后14 d免疫熒光染色標記神經元，假手術組無神經元損傷，永久性腦缺血組、生理鹽水組和長春西汀組的神經元損傷體積分別為16.39±3.26 mm3、13.87±3.00 mm3和5.06±0.38 mm3。4組整體差異有統(tǒng)計學意義（F=11.34，P＜0.001），兩兩比較顯示，永久性腦缺血組（P＜0.001）和生理鹽水組（P=0.001）神經元損傷體積大于假手術組，長春西汀組神經元損傷體積小于永久性腦缺血組（P=0.008）和生理鹽水組（P=0.037）。代表性染色圖可見永久性腦缺血組和生理鹽水組小鼠右腦缺血灶周圍神經元損傷明顯，長春西汀組神經元損傷相對較小（圖2）。

圖2 術后14 d小鼠腦神經元染色代表圖

2.4 小膠質細胞極化 術后14 d免疫熒光染色檢測小膠質細胞極化情況，4組間M1型小膠質細胞（CD16/32陽性）表達整體差異有統(tǒng)計學意義，兩兩比較顯示，永久性腦缺血組（P＜0.001）和生理鹽水組（P=0.005）M1型小膠質細胞表達高于假手術組，長春西汀組M1型小膠質細胞表達水平低于永久性腦缺血組（P＜0.001）和生理鹽水組（P=0.038），表明長春西汀組抑制CD16/32陽性的小膠質細胞的增加。4組間M2型小膠質細胞（CD206陽性）表達整體差異有統(tǒng)計學意義，兩兩比較顯示，長春西汀組M2型小膠質細胞表達水平顯著高于假手術組、永久性腦缺血組和生理鹽水組（均P＜0.001）（表3）。圖3為4組小鼠小膠質細胞表型表達的免疫熒光染色代表圖。

圖3 術后14 d小鼠缺血側皮層梗死周圍小膠質細胞免疫熒光染色代表圖

表3 模型成功后14 d小鼠小膠質細胞極化熒光強度數(shù)據(jù)

3 討論

既往研究證明，長春西汀能夠抑制大鼠腦組織的炎性反應，減少大鼠腦缺血再灌注后的腦梗死面積[17]，但其在永久性腦缺血損傷中是否有神經保護作用尚未見報道。本研究使用小鼠永久性腦缺血模型，連續(xù)給予長春西汀治療，觀察到長春西汀組能夠增加造模14 d時小鼠腦梗死區(qū)周邊的M2型小膠質細胞表達，減少M1型小膠質細胞的分布。另外，長春西汀還能減少小鼠腦缺血后的神經元損傷，促進神經元存活，提高小鼠的改良加西亞神經功能評分和增加轉棒測試中的運動時長和運動速度，上述結果提示長春西汀可能具有促神經元修復并改善神經功能的作用。

缺血性卒中由于組織缺血缺氧，腦組織內炎性反應增加，并引發(fā)后續(xù)炎性級聯(lián)反應。慢性的炎癥反應可進一步加大腦組織損傷的范圍和疾病的嚴重程度，是影響卒中轉歸的重要因素[5-6]。在生理狀態(tài)下，腦組織內小膠質細胞處于靜息狀態(tài)，腦組織缺血后，小膠質細胞可極化為具有促炎、細胞毒性的M1型和具有抗炎、神經營養(yǎng)作用的M2型兩種表型[18-19]。小膠質細胞的兩種極化表型可以影響腦缺血局灶區(qū)域炎癥反應的進程，并參與腦缺血后的神經營養(yǎng)與修復，從而影響疾病的預后。本研究中，小鼠永久性腦缺血后，長春西汀組減少皮層梗死周邊CD16/32陽性細胞表達，增加CD206陽性細胞表達，提示給予長春西汀注射液治療可促進小鼠永久性大腦中動脈遠端缺血后小膠質細胞由M1向M2表型極化，抑制缺血區(qū)免疫炎癥反應并促進組織修復，使得的炎性反應得到控制。長春西汀治療可調控腦缺血后局灶炎癥反應，從而改善永久性腦缺血后的炎性損傷，可能對小鼠長期損傷修復、疾病預后有積極意義。

本研究證實長春西汀注射液通過促進小膠質細胞極化為抗炎的M2型，并抑制促炎的M1型表達，調節(jié)小鼠腦內局灶炎癥反應，減少小鼠永久性腦缺血損傷后的腦組織損傷，改善運動功能，可為缺血性卒中的臨床治療提供用藥參考。但本研究中長春西汀組小鼠的改良加西亞評分各分項和總分、轉棒測試結果與生理鹽水組并無顯著差異，可能是因為研究樣本數(shù)量較少。另外，長春西汀如何影響小膠質細胞的極化尚需進一步研究。

【點睛】在小鼠大腦中動脈閉塞腦缺血模型中，長春西汀注射液可促使小膠質細胞極化為抗炎的M2型，減輕神經元損傷，經治療后小鼠的神經功能改善也比較明顯。本研究結果為長春西汀注射液治療缺血性卒中提供了一定的理論依據(jù)。