楊豐榕，高建萍，李春燕

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特 010110）

0 引言

生菜子，菊科植物萵苣(Lactuca satyaL.)的干燥種子，又名黑苣勝，是蒙藥方劑中較常用的藥材之一。蒙醫(yī)理論中認為其具有消食、調(diào)理胃火等功效，不僅可用于腹部鼓脹，面部浮腫等肝病，還可以治療嘔吐以及飲食后肝區(qū)疼痛等[1]。現(xiàn)代藥理研究后發(fā)現(xiàn)生菜子具有降血脂[2]、中樞抑制[3]、抗心律失常[4]等功效，但由于對生菜子的研究較少，其所含化學(xué)成分不明確，相關(guān)藥理活性的作用機制尚不清楚。

經(jīng)項目前期研究發(fā)現(xiàn)生菜子含有的主要化學(xué)成分之一為多糖，而多糖的多種藥理活性中包括降血脂[5]、降血糖[6-8]、抗氧化[9-11]等，其中多糖降血脂的機制包括直接降低體內(nèi)膽固醇、減少過氧化物生成等[12]，結(jié)合文獻中生菜子的降血脂作用，因此本文將生菜子多糖定為研究對象。

多糖的提取方法種類較多，有醇水法[13]、超聲法[14]、酶法[15]、微波法[16]等，其中最常用的還是醇水法，通過設(shè)計合理的正交試驗得到最佳工藝。誤差反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，簡稱為BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，是人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的機器學(xué)習(xí)方法[17-18]。本研究旨在將BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法與生菜子多糖提取的正交試驗結(jié)合，利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法實現(xiàn)過程模擬，考察細微變化對提取結(jié)果的影響，進而建立優(yōu)于正交試驗的生菜子多糖的最佳提取方法，同時研究生菜子多糖結(jié)合膽酸鹽能力從而實現(xiàn)對生菜子降血脂作用機制的初步研究，藉此實現(xiàn)對生菜子的深入研究并為多糖降血脂功效的研究提供部分理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生菜子，購自內(nèi)蒙古天力藥業(yè)，由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教研室渠弼教授鑒定為菊科植物萵苣(Lactuca satyaL.)的干燥黑色種子。膽酸鈉、牛黃膽酸鈉、甘氨膽酸鈉（上海源葉試劑公司）、葡萄糖（040510 天津市化學(xué)試劑三廠），其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

752-型-紫外分光光度計（上海光譜儀器有限公司）、電子天平（AB135-S；METTLER TOLEDO，TA5003W，上海菁海儀器有限公司）、FZ-600型酸度計（成都世紀方舟科技公司）、旋蒸儀（N-1300D-WB）

1.3 方法

1.3.1 生菜子預(yù)處理 生菜子藥材經(jīng)粉碎后，先經(jīng)石油醚脫脂，再以95%乙醇除低聚糖，后將藥材粉末干燥備用。

1.3.2 生菜子多糖提取工藝 采用水醇法：預(yù)處理生菜子粉末+蒸餾水→煎煮→真空抽濾→濃縮→80%醇沉→得生菜子多糖，依據(jù)公式(1)計算多糖得率。

1.3.3 單因素實驗 實驗采用的提取溫度分別選擇50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，提取時間選擇0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，提取次數(shù)選擇1、2、3、4次，溶劑倍量定為10、20、30、40、50、60倍，將以上4個因素作為生菜子多糖得率的主要影響因素進行單因素考察實驗。

1.3.4 正交試驗 以提取溫度(A)、提取時間(B)、提取次數(shù)(C)、溶劑倍量(D)為影響因素，以多糖得率作為指標展開正交設(shè)計試驗。

1.3.5 基于正交設(shè)計的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化[19-21]以正交試驗設(shè)計中影響生菜子多糖得率的4 個主要因素作為4個輸入節(jié)點建立的B P 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)輸入層，以得率作為輸出節(jié)點建立輸出層，將綜合評分作為評價指標。采用MAT LAB 7.0軟件實施編程，其中隱含層傳遞函數(shù)最終選擇tansig 雙曲正切傳遞函數(shù)，而輸出層傳遞函數(shù)則選擇purelin線性傳遞函數(shù)。

1.3.6 生菜子多糖體外結(jié)合膽酸實驗

（1）樣品制備。取生菜子藥材粗粉，44倍蒸餾水，89℃提取1.6 h，提取4次，得生菜子多糖提取液。濃縮后，以60%乙醇、80%乙醇分級醇沉、90%乙醇直接醇沉，得到3 個樣品，分別為：60%醇沉生菜子多糖、80%醇沉生菜子多糖、生菜子粗多糖。

（2）膽酸鹽標準曲線的繪制[22]

步驟：（1）以磷酸緩沖溶液(0.1 mol/L、pH 6.3)配制0.3 mmol/L 的?；悄懰徕c(STC)、甘氨膽酸鈉(SGC)和膽酸鈉(SC)溶液，備用；（2）分別取上述膽酸鹽溶液0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 于10 mL 具塞試管中，以磷酸緩沖溶液補充至2.5 mL；（3）加入7.5 mL 硫酸溶液（質(zhì)量分數(shù)60%）；（4）70℃水浴20 min 冰浴5 min；（5）于387 nm處測定吸光度值；（6）以吸光度值和膽酸鹽濃度繪制標準曲線。

（3）膽酸鹽結(jié)合實驗。取1 mL 的多糖溶液（粗多糖，60%醇沉，80%醇沉，分別配置成0.5、1、1.5、2、2.5、3 mg/mL）于10 mL 具塞試管中，加入1 mL HCl 溶液(0.01 mol/L)，37℃恒溫1 h，以NaOH溶液(0.1 mol/L)調(diào)節(jié)pH 6.3，隨后加入4 mL 胰酶（10 mg/mL，pH 6.3 的0.1 mol/L 磷酸緩沖液配制），于37℃恒溫震蕩1 h 后，每個樣品中分別再加入4 mL 不同的膽酸鹽溶液，于37℃恒溫振蕩1 h后，待膽酸鹽被充分結(jié)合后，4000 r/min，離心20 min。上清液按1.3.6.2項下方法測定膽酸鹽含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素考察結(jié)果

單因素考察結(jié)果見圖1～4。當生菜子多糖的提取溫度為50℃～70℃時，多糖得率與溫度成正比，高溫促使多糖的溶出加速，但是當溫度超過70℃時，高溫可能導(dǎo)致使多糖發(fā)生降解或者一定程度的糊化，從而使多糖的得率下降；當提取時間為0.5～1.0 h 時，時間與多糖得率成正比，當提取時間超過1.5 h 時，多糖的得率基本趨于穩(wěn)定；提取次數(shù)與多糖得率成正比，次數(shù)越多提取越充分，經(jīng)過提取3次后多糖得率則趨于平穩(wěn)；溶劑用量越多，多糖得率越高，但大量提取液需要濃縮，導(dǎo)致時間和能源的浪費，因此應(yīng)選擇適當?shù)娜軇┍读俊?/p>

圖1 提取溫度對黑苣勝多糖提取率的影響

2.2 正交試驗結(jié)果

依據(jù)單因素考察結(jié)果建立正交設(shè)計實驗，相關(guān)因素和水平及試驗結(jié)果見表1～3。由表3可知，提取次數(shù)是生菜子多糖的提取工藝的主要影響因素，其余各個因素對生菜子多糖得率無顯著影響。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗結(jié)果

表3 生菜子多糖提取實驗方差分析表

2.3 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化結(jié)果

本實驗所建立的BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)最大學(xué)習(xí)步長為1000，目標精度0.001，訓(xùn)練過程穩(wěn)定迅速，其穩(wěn)定性結(jié)果可見圖5～6。此網(wǎng)絡(luò)以正交試驗所得數(shù)據(jù)作為參考數(shù)據(jù)，模擬提取實驗中未進行的數(shù)據(jù)考察，可以由計算機實現(xiàn)1℃、1 倍水量、1 min 對生菜子多糖得率的影響，從而得到最優(yōu)結(jié)果。固定3個影響因素，仿真一個因素后所得的工藝為：89℃，44倍水，提取4次，1.6 h/次，結(jié)果見圖7～10。

圖2 提取時間對黑苣勝多糖提取率的影響

圖3 提取次數(shù)對黑苣勝多糖提取率的影響

圖4 溶劑的倍量對黑苣勝多糖提取率的影響

圖5 誤差收斂曲線

圖6 回歸相關(guān)性擬合曲線

圖7 針對提取溫度的仿真

圖8 針對提取時間的仿真

圖9 針對溶劑倍量的仿真

圖10 針對提取次數(shù)的仿真

2.4 生菜子多糖體外結(jié)合膽酸實驗結(jié)果

由表4可知，生菜子粗多糖（粗）、60%醇沉(60%)、80%醇沉多糖(80%)對?；悄懰徕c(STC)、甘氨膽酸鈉(SGC)和膽酸鈉(SC)都有較好的結(jié)合率，并與多糖濃度在一定范圍內(nèi)呈正比。

表4 不同生菜子多糖對3種膽酸鹽的結(jié)合率

3 討論

通過本項目研究補充了目前針對生菜子這味藥食同源蒙藥的研究，發(fā)現(xiàn)了其所含主要化學(xué)成分是多糖，并對生菜子多糖的提取分離方法進行了研究，填補了此味藥材在化學(xué)成分提取方法上的空白。由項目最終多糖得率可知采用BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型所得的生菜子多糖提取工藝優(yōu)于正交試驗，并且在不增加試驗次數(shù)的基礎(chǔ)上就可以考察到更細微的條件變化，節(jié)約人力物力，僅利用少量數(shù)據(jù)即可通過計算機軟件分析各個影響提取的因素對生菜子多糖得率的影響規(guī)律，并找到最佳參數(shù)且此結(jié)果優(yōu)于正交試驗結(jié)果，說明BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法值得用于化學(xué)成分提取工藝的改進。

本研究通過利用模擬腸胃條件的方法進行了生菜子多糖膽酸鹽結(jié)合試驗，發(fā)現(xiàn)多糖濃度高于2 mg/mL時，對膽酸鈉的結(jié)合率反而下降，可能是由于多糖分子比較大，當濃度過高時，在空間上阻礙了其與膽酸鈉的結(jié)合，尚需結(jié)合體內(nèi)實驗進一步研究。

有學(xué)者認為藥食同源的植物中功能性成分能夠于腸道結(jié)合內(nèi)膽酸鹽，部分可以通過影響脂類消化和吸收降血脂，還可以通過影響膽酸鹽的腸肝循環(huán)，使之排出體外，并促使膽固醇向膽酸鹽轉(zhuǎn)化來降低血脂[25-26]，結(jié)合本項目研究結(jié)果，可初步判斷生菜子降低血脂的藥理作用機制為生菜子多糖對膽酸鹽的結(jié)合作用，從而表明多糖是生菜子藥材降血脂效果的主要有效成分之一，能夠為以后蒙藥生菜子藥理活性研究打下了基礎(chǔ)并指明將來的研究方向。

4 結(jié)論

正交試驗作為常見的研究設(shè)計方法，不但經(jīng)濟、高效、快速，而且可以針對多因素多水平，局限是只能優(yōu)化研究者提供的多個水平的組合，而BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可以學(xué)習(xí)規(guī)則，并實現(xiàn)自身訓(xùn)練，不僅能夠給定范圍尋優(yōu)，還能預(yù)測范圍中的最優(yōu)值，得到更加可靠，穩(wěn)定的結(jié)果[23-24]。

根據(jù)本項目優(yōu)化得到的工藝平行進行3次生菜子多糖的提取實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此工藝中多糖得率優(yōu)于正交試驗結(jié)果，平均為11.17%，證明此最優(yōu)工藝穩(wěn)定并且可行，同時具有良好的重復(fù)性。

在生菜子多糖的膽酸鹽結(jié)合實驗中，隨著3 種多糖的濃度增大，對牛黃膽酸鈉的吸附力增強，當多糖濃度高于2 mg/mL 時，對其結(jié)合率基本穩(wěn)定。多糖濃度增加，對甘氨膽酸鈉的吸附能力呈正比，在多糖濃度為3 mg/mL 時達到吸附最大值，表明生菜子多糖可以重點吸附此類膽酸鹽。而3種多糖對膽酸鈉的吸附在多糖濃度為0.5～2 mg/mL時，逐步增加，但是當多糖濃度高于2 mg/mL 時，對膽酸鈉的結(jié)合率反而下降。在3種多糖中，生菜子粗多糖對不同膽酸鹽的結(jié)合率最佳，其次是60%醇沉多糖，80%醇沉多糖。

本項目僅從體外對生菜子多糖的降血脂作用進行了研究，后期實驗將進一步對生菜子多糖在高血脂動物模型中的降血脂能力進行研究。