王蘊涵， 杜群， 李燕舞， 肖蘇婷， 喬楊

（廣州中醫(yī)藥大學科技創(chuàng)新中心，廣東廣州 510405）

急性肺損傷（acute lung injury）是由感染、創(chuàng)傷、有害氣體吸入、休克、中毒等多種因素所導致的以肺彌散功能障礙為特征的肺部疾病[1]，在臨床中病死率較高，常危及生命[2]。目前，除了傳統(tǒng)的治療原發(fā)病、呼吸支持及使用糖皮質(zhì)激素外，國內(nèi)外關于其生理病理機制的研究也在不斷開展，旨在為急性肺損傷提供更好的治療方法。中醫(yī)學并無“急性肺損傷”這一疾病名稱，而是根據(jù)其發(fā)病時的癥狀、體征將其歸屬于“喘脫”“結(jié)胸”“暴喘”等病證的范疇[3]。臨床上急性肺損傷患者多為陽明燥實，熱毒結(jié)于大腸，腑氣不通，形成陽明腑實之證，基于中醫(yī)藏象理論“肺與大腸相表里”“肺合大腸”，臨床上多采用肺腸同治之法[4]。大承氣湯出自《傷寒論》，是肺腸同治法臨床應用的代表方劑，被廣泛應用于急性肺損傷的治療，效果顯著[5-8]；但其作用機制尚不清楚。因此，本研究通過網(wǎng)絡藥理學的方法初步探討大承氣湯治療急性肺損傷的主要活性成分及潛在靶點，并加以體外實驗驗證，以期闡明其作用機理?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡藥理學預測

1.1.1 大承氣湯藥物化學成分收集及藥物靶點預測登錄中藥系統(tǒng)網(wǎng)絡藥理學數(shù)據(jù)庫選擇TCMSPTM（網(wǎng)址http:∕∕ibts.hkbu.edu.hk∕LSP∕tcmsp.php），設置搜索條目為Herb name。設置篩選條件為口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性指數(shù)（DL）≥0.18，篩選大承氣湯的目標靶點（targets information）。數(shù)據(jù)庫所獲得的藥物有效化學成分及靶點信息應用Drugbank（https:∕∕www.drugbank.ca∕）使 其 格 式 標 準化。因TSMSP數(shù)據(jù)庫中尚未收錄芒硝的藥物成分及靶點，登錄BATMAN數(shù)據(jù)庫（網(wǎng)址：http:∕∕bionet.ncpsb.org.cn），在搜索條目下以“mang xiao”為關鍵詞搜索，收集芒硝的藥物成分靶點。

1.1.2 疾病靶點來源登錄GeneCards人類基因數(shù)據(jù)庫[9]（THE HUMAN GENE DATABASE），網(wǎng)址https:∕∕www.genecards.org∕。設置搜索條目為關鍵詞搜索人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man）[10]，網(wǎng) 址https:∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕omim。搜索條目下以“acute lung injury”為關鍵詞篩選，設置物種為人（Homo sapiens），獲取急性肺損傷的疾病靶點。對數(shù)據(jù)庫檢索到的疾病靶點進行合并去重，作為最終的疾病靶點來源。

1.1.3 復方-疾病交集基因的獲取應用R語言中的在線程序Draw Venn Diagrams對“1.1.1”項與“1.1.2”項中獲取到的大承氣湯藥物靶點與急性肺損傷疾病靶點進行匹配，獲得交集基因靶點，作為大承氣湯治療急性肺損傷的潛在作用靶點并繪制韋恩圖。

1.1.4 化學成分-靶點網(wǎng)絡圖的構(gòu)建將“1.1.3”項中獲取到的交集基因?qū)氲骄W(wǎng)絡可視化軟件Cytoscape 3.8.0，構(gòu)建化學成分-靶點作用網(wǎng)絡。對網(wǎng)絡進行分析，以度值參數(shù)作為評價節(jié)點在網(wǎng)絡中重要性的標準。

1.1.5 大承氣湯治療急性肺損傷的蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡構(gòu)建及核心蛋白篩選登錄String數(shù)據(jù)庫，網(wǎng) 址https:∕∕string-db.org∕。選 擇Multiple proteins，在搜索條目下輸入“1.1.3”項獲取到的交集基因，限定物種為人（Homo Sapiens），其余設置保持不變，構(gòu)建PPI功能網(wǎng)絡，并繪制網(wǎng)絡圖。為篩選核心蛋白，將生成的PPI條目Node1、Node2以及Combined-scorce導入到Cytoscape3.8.0，應用Network Analyse插件分析網(wǎng)絡，選擇APP條目下的CytoNCA插件進行網(wǎng)絡拓撲分析。

1.1.6 基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科（KEGG）通路富集分析基于R語言對“1.1.3”項中獲取到的交集基因的細胞成分、分子功能、生物學過程以及信號通路進行富集分析。首先將基因Symbol轉(zhuǎn)化為基因ID，選擇物種為人（Homo sapiens），設定閾值為P＜0.05，輸出富集結(jié)果并繪制條形圖與氣泡圖。

1.2 體外實驗驗證

1.2.1 藥物、試劑與儀器木犀草素（luteolin）[高效液相色譜（HPLC）>98%，成都普菲德生物技術有限公司]；蘆薈大黃素（aloe-emodin）（HPLC>97%，成都普菲德生物技術有限公司）；柚皮素（naringenin）（HPLC>99%，成都普菲德生物技術有限公司）。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（大腸桿菌055：B5）（美國Sigma-Aldrich公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒、小鼠白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）ELISA試劑盒（碧云天生物技術公司）；P53兔多克隆抗體（Protein-Tech Group公司）；GAPDH兔多克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的兔免疫球蛋白（IgG）抗體（ABCAM公司）。酶標儀（美國Thermo Fisher公司）。

1.2.2 細胞培養(yǎng)本實驗選用小鼠單核巨噬細胞RAW264.7（購自上海中科院細胞庫）。在實驗開始前先把RAW264.7細胞放置于37℃、體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中，給予體積分數(shù)10%胎牛血清（FBS）DMEM培養(yǎng)基處理以提供必要的生長條件。培養(yǎng)2~3 d達到90%聚集，再以1∶5的比例傳代培養(yǎng)用于實驗。

1.2.3 MTT實驗本研究采用MTT法分析評估木犀草素、蘆薈大黃素、柚皮素對RAW264.7細胞活力的影響，并由此確定合理的藥物濃度。首先將細胞以1×105個∕孔的密度接種在96孔板中，待細胞貼壁后，培養(yǎng)12 h，然后用含有不同濃度木犀草素、蘆薈大黃素、柚皮素（0、1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50、100μmol∕L）的培養(yǎng)基處理細胞24 h。接著，將20μL MTT（5 mg∕mL）添加到每個孔中，于37℃中溫育4 h后棄去培養(yǎng)基，于每個孔中加入100μL二甲基亞砜（DMSO）溶解已經(jīng)形成的甲瓚晶體，應用酶標儀，選擇最佳測量波長570 nm，測量每個孔的吸光度。

1.2.4 ELISA實驗本研究采用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)基上清TNF-α和IL-6水平。根據(jù)實驗需求將RAW264.7細胞以3×106個∕孔的密度接種在6孔板中，給予與“1.2.3”項相同濃度、時間的藥物刺激，收集RAW264.7細胞培養(yǎng)基上清，根據(jù)說明書方法進行操作。最后應用酶標儀，選擇最佳測量波長450 nm，測量每個孔的吸光度。

1.2.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）實驗同“1.2.4”項的細胞培養(yǎng)及刺激方式。去掉RAW264.7細胞培養(yǎng)基上清，使用預冷的PBS洗滌2次，加入結(jié)合蛋白酶抑制劑混合物的放射免疫沉淀分析（RIPA）緩沖液裂解處理后的RAW264.7細胞，提取總蛋白。通過8%~12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，并將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，用50 g∕L脫脂牛奶封閉。將PVDF膜與P53抗體4℃孵育過夜后，再與HRP標記的IgG抗體孵育。應用GE ImageQuant LAS4000mini（美國GEHealthcare公司）觀察目的條帶，并應用Gel Doc XR系統(tǒng)（美國Bio-Rad Laboratories）采用光密度法定量，最后應用Quantity One蛋白質(zhì)分析軟件（美國Bio Rad公司）進一步分析。

2 結(jié)果

2.1 復方化學成分及藥物靶點本次研究經(jīng)過合并去重，共收集大承氣湯藥物化學成分27個，預測靶點82個。

2.2 疾病靶點的獲取在GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫中以“acute lung injury”為關鍵詞進行檢索，通過R軟件的venn程輯包將2個數(shù)據(jù)庫中所得到的疾病靶點匯總并刪除重復。為保證數(shù)據(jù)的準確性，GeneCards數(shù)據(jù)庫按照Relevance Score＞10篩選，共獲得2 801個疾病靶點，通過UniProt數(shù)據(jù)庫對疾病靶基因進行校正，將其作為候選靶標來源。

2.3 獲取復方-疾病交集基因基于R語言3.6.0軟件，在R語言中Bioconductor（https:∕∕www.bioconductor.org∕）網(wǎng)站安裝VennDiagram程輯包，將“1.1.1”項與“1.1.2”項中獲得的復方藥物靶點與疾病靶點數(shù)據(jù)導入到R軟件，應用Draw Venn Diagrams在線程序獲取交集基因并繪制韋恩圖，見圖1。共獲得復方-疾病交集基因55個。

圖1 大承氣湯-急性肺損傷交集基因韋恩圖Figure 1 Venn diagram of intersection between Dachengqi Decoction-acute lung injury

2.4 構(gòu)建有效成分-靶點網(wǎng)絡圖運用Cytoscape 3.8.0軟件中Import Network插件構(gòu)建復方有效化學成分-靶點作用網(wǎng)絡，見圖2。網(wǎng)絡共有145個節(jié)點，297條邊。核心靶標顯示為方形，活性化學成分顯示為圓形，不同藥物顯示為不同顏色，其中，大黃顯示為紅色，芒硝顯示為綠色，枳實顯示為紫色，厚樸顯示為藍色。網(wǎng)絡中化合物與靶點的關系用每條邊來顯示。一個化學成分與多個交集基因靶點對應，且一個交集基因與靶點也同時對應多個化學成分，化學成分又從屬于不同的中藥，這說明大承氣湯治療急性肺損傷的過程是多成分、多靶點的。

圖2 大承氣湯化學成分-靶點作用網(wǎng)絡Figure 2 Active ingredient-target network of Dachengqi Decoction

2.5 核心蛋白相互作用網(wǎng)絡構(gòu)建及核心蛋白篩選應用String數(shù)據(jù)庫對交集基因初步構(gòu)建蛋白作用網(wǎng)絡，見圖3。節(jié)點代表蛋白，邊代表蛋白與蛋白之間的作用關系。網(wǎng)絡連接程度越高說明蛋白之間關系越密切。將String數(shù)據(jù)庫得到的string_interactions.txt文件導入到Cytoscape 3.8.0軟件，應用Network Analyse插件構(gòu)建網(wǎng)絡，選擇CytoNCA插件進行網(wǎng)絡拓撲分析，篩選網(wǎng)絡中的關鍵節(jié)點。核心蛋白篩選參數(shù)：介度中心性（Betweenness Centrality），緊密中心性（Closeness Centrality），節(jié)度中心性（Degree Centrality），特征向量（Eigenvector Centrality），局 部 連 通 性（Local Average Connectivity-based method，LAC）。篩選條件：應用R軟件的在線程輯包，對各交集基因上述核心蛋白篩選參數(shù)數(shù)值進行測算，各組數(shù)值中大于本組中位值的基因予以保留，運行R腳本，篩選核心蛋白，見表1，篩選流程見圖4。

圖3 大承氣湯與急性肺損傷的PPI網(wǎng)絡圖Figure 3 PPInetwork diagram of Dachengqi Decoction and acute lung injury

圖4 CytoNca核心蛋白基因篩選流程圖Figure 4 Screening flowchart of CytoNca core protein genes

表1 核心蛋白拓撲分析Table 1 Topological analysis of core proteins

2.6 交集基因的GO功能富集分析基于R軟件3.6.0對大承氣湯治療急性肺損傷的55個作用靶點進行GO功能富集分析。富集內(nèi)容包括細胞成分（celluar component，CC）、生物學過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）。富集條件為P值=0.05且Q值=0.05。通過分析發(fā)現(xiàn)，富集到了1 957個GO條目，細胞成分83個，生物學過程1 714個，分子功能160個。選取各排名前10位的富集條目，并根據(jù)每個項目的P值、Q值及富集在其上的基因數(shù)目繪制條形圖，見圖5。橫坐標表示靶點數(shù)，左邊表示BP、CC、MF，顏色表示P值，P值越小顏色越偏向紅色，P值越大則越偏向藍色。

圖5 大承氣湯治療急性肺損傷的GO功能富集分析Figure 5 GO function enrichment of Dachengqi Decoction in treating acute lung injury

2.7 交集基因的KEGG通路富集分析基于R語言對交集基因進行KEGG通路富集分析。分析結(jié)果可見，55個復方疾病交集基因共富集到了126條通路（P＜0.05）。選取排名前20位的富集通路，根據(jù)每個通路的P值、Q值及富集在其上的基因數(shù)目繪制氣泡圖，見圖6。橫坐標表示富集到基因的數(shù)量，左邊表示通路名稱，顏色表示P值，P值越小顏色越偏向紅色，P值越大則越偏向藍色。主要涉及到P53信號通路。

圖6 大承氣湯與急性肺損傷交集基因KEGG通路富集圖Figure 6 KEGG pathway enrichment of Dachengqi Decoction in treating acute lung injury

2.8 木犀草素、蘆薈大黃素、柚皮素能降低LPS誘導的RAW264.7細胞中TNF-α、IL-6細胞因子水平MTT的數(shù)據(jù)結(jié)果表明，相較于正常對照組（Ctrl，藥物濃度為0μmol∕L），濃度小于100μmol∕L的柚皮素組和蘆薈大黃素組以及濃度小于12.5μmol∕L的木犀草素組對RAW264.7細胞沒有毒性，具體結(jié)果見圖7。藥效實驗的結(jié)果表明，柚皮素和蘆薈大黃素從10μmol∕L濃度，木犀草素從2μmol∕L濃度開始，具有一定抑制TNF-α、IL-6細胞因子分泌的能力，且細胞因子的分泌水平呈劑量依賴性地降低，具體結(jié)果見圖8。

圖7 木犀草素、蘆薈大黃素、柚皮素對RAW264.7細胞活性的影響Figure 7 Effects of luteolin，aloe-emodin and naringenin on RAW264.7 cell activity

圖8 木犀草素、蘆薈大黃素、柚皮素對RAW264.7細胞TNF-α和IL-6分泌的影響Figure 8 Effects of luteolin，aloe-emodin and naringin on secretion of TNF-αand IL-6 in RAW264.7 cells

2.9 木犀草素、蘆薈大黃素、柚皮素降低LPS誘導的RAW264.7細胞中P53蛋白表達根據(jù)網(wǎng)絡藥理學預測結(jié)果，TP53基因在構(gòu)建的成分-靶點-通路網(wǎng)絡中，度值較大且控制著P53蛋白的表達。因此，本研究檢測P53蛋白表達，對網(wǎng)絡藥理學預測靶點進行驗證。Western Blot實驗結(jié)果顯示，與模型組比較，木犀草素、蘆薈大黃素、柚皮素的干預能顯著降低P53蛋白的表達，且與給藥劑量呈現(xiàn)一定的量-效關系，具體結(jié)果見圖9。

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡藥理學的方法探討大承氣湯治療急性肺損傷的作用機制。根據(jù)OB和DL參數(shù)，共篩選出大承氣湯化學成分27個，預測靶點經(jīng)合并去重收集82個。構(gòu)建有效成分-靶點網(wǎng)絡圖，結(jié)果表明，木犀草素（MOL000006 luteolin）、蘆薈大黃素（MOL000471 aloe-emodin）、柚皮素（MOL004328 naringenin）等是其主要的化學成分。既往的藥理學研究表明，木犀草素抗炎作用較強，能抑制IL-6、TNF-α等炎癥細胞因子的表達，并且能夠提高IL-10的表達水平來調(diào)控炎癥反應[11]。周曉玲[12]研究發(fā)現(xiàn)，蘆薈大黃素具有體外抗炎作用，能夠以劑量依賴的方式降低LPS刺激的RAW264.7細胞中NO、TNF-a、IL-1β的釋放。柚皮素具有較強的抗炎及抗氧化作用，薛傳優(yōu)等[13]研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素可以降低IL-1β、IL-6和TNF-α基因的表達水平，改善脂多糖誘導的H9c2心肌細胞的炎癥反應和細胞凋亡。

經(jīng)過對55個交集基因蛋白進行核心蛋白篩選，結(jié)果顯示TP53、JUN、MYC等是大承氣湯治療急性肺損傷起到重要作用的核心蛋白。Laurent等[14]發(fā)現(xiàn)TP53表達細胞的比例與炎癥強度相關。SONG等[15]研究發(fā)現(xiàn)，c-Jun能夠激活NLRP3炎癥小體，促進其磷酸化，介導炎癥反應。黃杰中等[16]研究發(fā)現(xiàn)，c-Myc與凋亡抑制因子呈正相關，表明其可以顯著地抑制細胞凋亡。急性肺損傷的發(fā)病往往繼發(fā)于肺部疾患的炎癥反應，伴隨著肺部毛細血管的損傷，引起細胞凋亡?？梢钥闯鯰P53、JUN、MYC均與急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展具有一定的相關性。

交集基因KEGG通路富集分析顯示，其通路主要為P53信號通路。Wu等[17]的研究表明，通過抑制P53相關信號通路可以減輕類風濕關節(jié)炎炎癥反應。炎癥信號通路NF-κB蛋白表達水平亦可以影響凋亡因子P53的表達[18]。P53被認為是NF-κB調(diào)控的細胞凋亡因子，可以直接或間接影響參與細胞呼吸的多種酶的表達，并通過增加氧化磷酸化促進活性氧的產(chǎn)生[19]。也有研究認為，P53是調(diào)控細胞應答多種胞外信號的重要轉(zhuǎn)錄因子，可以增加促炎因子的產(chǎn)生[20]。

本研究通過細胞實驗證實，木犀草素、蘆薈大黃素、柚皮素均具有減少巨噬細胞炎癥細胞因子TNF-α、IL-6釋放的作用。Western Blot結(jié)果顯示，3種活性成分均可劑量依賴性地降低P53蛋白的表達，對機體的炎癥反應具有一定的抑制作用。

綜上所述，本研究將網(wǎng)絡藥理學和生物信息學相結(jié)合，從網(wǎng)絡層面系統(tǒng)地分析預測了大承氣湯治療急性肺損傷的化合物-靶點-通路作用機制，使用細胞實驗和分子生物學方法驗證了其藥效與分子機制，這與中醫(yī)的整體觀念和辨證論治的理念相符合，為今后的相關研究和實驗設計提供了參考和新思路。