秦 萍，李章春，劉 燕，謝洪書

(黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州 都勻 558000)

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)是臨床骨科較為常見的一種非細(xì)菌性、非對(duì)稱性的慢性退行性疾病，主要特征為關(guān)節(jié)軟骨的退化和退變，臨床表現(xiàn)多為膝關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、活動(dòng)受限、功能障礙、畸形等[1]。研究顯示，KOA的全球發(fā)病率約為12%，我國患病率為5.4%～30.5%[2]。中老年是該疾病的高發(fā)群體，嚴(yán)重影響患者日常生活及生命質(zhì)量。盡管KOA的具體發(fā)病機(jī)制還不十分明確，但相關(guān)研究認(rèn)為，IL-1β、IL-6等炎癥因子在其早、中期的發(fā)生與發(fā)展過程中具有關(guān)鍵作用[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)常用的抗炎鎮(zhèn)痛藥物主要是糖皮質(zhì)激素、臭氧等藥物，然而由于此類藥物易對(duì)腸胃產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，所以治療效果并不理想[4]。中醫(yī)藥具有價(jià)格低廉、副作用小、止痛快等特點(diǎn)，在KOA的早、中期治療過程中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[5]。魚腥草揮發(fā)油是魚腥草的主要成分，具有抗炎、抗病毒等作用[6]，目前已進(jìn)行多項(xiàng)疾病的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究，但有關(guān)KOA的相關(guān)研究未見報(bào)道。通過觀察魚腥草揮發(fā)油對(duì)KOA大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平的影響，進(jìn)一步探討魚腥草揮發(fā)油的抗炎作用及機(jī)制，為臨床治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物分組與藥物

60只健康SD大鼠，雌雄各半，體重200～220 g，單位：長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)SCXK[湘]2019-0013。隨機(jī)分為假手術(shù)組(正常對(duì)照組)、模型組(KOA模型對(duì)照組)、陽性藥物組(陽性藥物對(duì)照組)、魚腥草揮發(fā)油高中低劑量組，每組10只，分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。鹽酸氨基葡萄糖片(國藥準(zhǔn)字H20060647，江蘇正大清江制藥有限公司生產(chǎn))。

1.1.2 試劑與儀器

IL-1β、IL-6和TNF-α檢測(cè)試劑(武漢純度生物科技有限公司生產(chǎn))、注射用青霉素鈉(國藥準(zhǔn)字H13020431，華北制藥股份有限公司生產(chǎn))、全自動(dòng)酶標(biāo)儀(mindrady MR-96A)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備

依據(jù)文獻(xiàn)[7]，假手術(shù)組大鼠在切口皮膚打開關(guān)節(jié)腔后，僅進(jìn)行生理鹽水沖洗，進(jìn)行縫合，不破壞半月板、韌帶等組織。其余組大鼠采用改良Hulth法進(jìn)行造模：將大鼠用乙醚麻醉，仰臥位固定在操作臺(tái)上，取右側(cè)膝關(guān)節(jié)進(jìn)行模型制備，常規(guī)備皮和消毒，無菌條件下于髕骨旁內(nèi)側(cè)行2 cm左右切口，逐層打開皮膚、筋膜，暴露關(guān)節(jié)腔，屈曲膝關(guān)節(jié)，依次剪斷前交叉和內(nèi)側(cè)副韌帶，摘除內(nèi)側(cè)半月板。術(shù)中保護(hù)好其他周圍組織，切勿傷及關(guān)節(jié)軟骨面。用生理鹽水對(duì)關(guān)節(jié)腔進(jìn)行清洗2～3次，逐層進(jìn)行縫合。術(shù)后每組大鼠進(jìn)行肌肉注射青霉素，劑量40萬U/d，連續(xù)注射7 d。第8 d開始每天驅(qū)趕大鼠活動(dòng)，2次/d，每次30 min左右，連續(xù)驅(qū)趕4周，4周后開始給藥治療。

1.2.2 藥物提取與給藥

依據(jù)文獻(xiàn)[8-9]方法進(jìn)行魚腥草揮發(fā)油的提取。將100 g干魚腥草粉碎，以1∶10的比例將料液與入蒸餾水進(jìn)行充分混合，常溫下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中浸泡10 h，70℃加熱回流10 h，停止加熱，收集揮發(fā)油。以吐溫-80為乳化劑，溶于生理鹽水，配制成0.5%吐溫-80的揮發(fā)油制備液，儲(chǔ)存?zhèn)溆?。給藥方法[10]：陽性藥物組給予鹽酸氨基葡萄糖水溶液灌胃治療(劑量0.26 g/kg)；魚腥草揮發(fā)油高、中、低劑量組分別以100 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg揮發(fā)油制備液進(jìn)行灌胃治療；模型組和假手術(shù)組給予同陽性藥物組相同劑量的蒸餾水灌胃，連續(xù)給藥6 w，1次/d。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)取材

于末次給藥后的次日稱取大鼠質(zhì)量，股動(dòng)脈取血處死大鼠，經(jīng)靜置、離心，取上清液備用。截取大鼠膝關(guān)節(jié)及滑膜組織置于4%的多聚甲醛固定，取腎臟、肝臟、脾臟等組織，計(jì)算臟器指數(shù)。

1.2.4 標(biāo)本處理

取經(jīng)多聚甲醛固定的大鼠膝關(guān)節(jié)組織，經(jīng)常規(guī)組織脫水、包埋、脫蠟等處理，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)改變。

1.2.5 IL-1β、IL-6和TNF-α檢測(cè)

ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平，嚴(yán)格遵循說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同組別大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較

與正常組比較，模型組和各藥物治療組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，各藥物治療IL-1β、IL-6和TNF-α水平均有不同程度的降低，其中陽性藥物組和高劑量組炎癥因子水平降低最為明顯，兩組間IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 不同組別大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較

2.2 不同組別大鼠膝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)觀察比較

組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，正常組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜未見異常改變(圖1)；模型組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織內(nèi)可見纖維組織明顯增生及大量炎癥細(xì)胞浸潤(圖2)；與模型組相比，各治療組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織炎癥病理學(xué)改變均有不同程度減輕，其中高劑量組間質(zhì)輕度纖維化，慢性炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象明顯好轉(zhuǎn)，與陽性對(duì)照組病變緩解程度相近(圖3～6)。

圖1 正常組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織切片(HE×400)Fig.1 Tissue sections of synovium of knee joint in normal group(HE×400)

圖2 模型組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織切片(HE×400)Fig.2 Tissue sections of synovium of knee joint in model group(HE×400)

圖3 陽性藥物組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織切片(HE×400)Fig.3 Tissue sections of synovium of knee joint in positive medicine group(HE×400)

圖4 高劑量組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織切片(HE×400)Fig.4 Tissue sections of synovium of knee joint in high dosage group(HE×400)

圖5 中劑量組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織切片(HE×400)Fig.5 Tissue sections of synovium of knee joint in medium dosage group(HE×400)

圖6 低劑量組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織切片(HE×400)Fig.6 Tissue sections of synovium of knee joint in low dosage group(HE×400)

3 討論

KOA的病變通常是從膝關(guān)節(jié)軟骨退行性改變開始，此后逐漸累及滑膜、關(guān)節(jié)腔等組織結(jié)構(gòu)。有關(guān)發(fā)病機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子、遺傳學(xué)、自身免疫等因素在其發(fā)生與發(fā)展過程中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)[11-12]，KOA病變的一個(gè)重要原因是軟骨細(xì)胞異常分化，引起TNF-α、IL-1β、IL-6等分解代謝因子分泌加劇，這些炎癥因子與滑膜、關(guān)節(jié)軟骨的破壞關(guān)系十分密切。顏春魯[7]等對(duì)KOA大鼠炎性因子表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β、IL-6和TNF-α在KOA大鼠血清內(nèi)為高表達(dá)；金劍飛等[13]對(duì)KOA大鼠NF-κB信號(hào)通路進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制NF-κB通路能夠下調(diào)IL-1β、IL-6和TNF-α炎癥因子水平，對(duì)KOA大鼠炎癥起到緩解作用。在本研究中，與正常組比較，模型組和各藥物治療大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均顯著升高(P<0.05)，表明模型制備導(dǎo)致KOA大鼠炎癥因子水平升高，該研究結(jié)果與此前相關(guān)研究結(jié)果較為一致。6 w給藥治療結(jié)束后，與模型組比較，各藥物治療組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均不同程度降低，其中陽性藥物組和魚腥草揮發(fā)油高劑量組下降最為明顯，且兩組間比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明魚腥草揮發(fā)油能夠?qū)OA大鼠炎癥因子發(fā)揮抑制作用。

魚腥草屬三白草科蕺菜屬植物蕺菜的全草或地上部分，性微寒、味辛，具有消癰排膿、清熱解毒、利尿除濕的功效。魚腥草揮發(fā)油是其主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、清除自由基等多種生物活性功能[14]。李少金等[8]通過對(duì)魚腥草揮發(fā)油對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，魚腥草揮發(fā)油能夠降低大鼠IL-6和TNF-α水平，對(duì)心肌缺血再灌注大鼠損傷發(fā)揮保護(hù)作用。黃定根等[15]通過魚腥草揮發(fā)油對(duì)去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松的預(yù)防作用進(jìn)行研究，結(jié)果表明，魚腥草揮發(fā)油能夠通過降低小鼠血清IL-1β和TNF-α水平，對(duì)去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松發(fā)揮保護(hù)作用。在本研究中，與模型組比較，陽性藥物組和魚腥草揮發(fā)油高劑量KOA大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平下降最為明顯，病理觀察顯示，高劑量組間質(zhì)輕度纖維化，慢性炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象明顯好轉(zhuǎn)，與陽性對(duì)照組病變緩解程度相近，表明魚腥草揮發(fā)油對(duì)KOA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織具有保護(hù)作用，且呈劑量依賴性。

綜上所述，研究認(rèn)為魚腥草揮發(fā)油能夠緩解KOA大鼠的炎癥，其作用機(jī)制可能與抑制炎癥因子表達(dá)有關(guān)，因魚腥草揮發(fā)油的應(yīng)用研究尚處探索階段，其確切作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。