臧茂林， 余夢迪， 陳重華， 黃夢琪， 羅 鵬， 樊紅琨， 楊 春

(1. 鄭州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系， 鄭州 450000； 2. 鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)系， 鄭州 450000)

慢性心力衰竭是多種心血管系統(tǒng)疾病的終末階段，具有高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響病人的生命質(zhì)量，其病理生理過程一直是研究的重點(diǎn)。心衰的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，臨床中常用心功能作為評(píng)價(jià)指標(biāo)[1]。腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)通過升高主動(dòng)脈壓，造成心臟后負(fù)荷增加，心肌代償性肥厚，心室容積增加，心臟擴(kuò)大，后期心臟失代償，最終形成心力衰竭。通過研究心衰過程中心臟結(jié)構(gòu)和功能的動(dòng)態(tài)變化，有助于發(fā)現(xiàn)心衰早期診斷指標(biāo)，而提前發(fā)現(xiàn)并治療心力衰竭對(duì)病人的預(yù)后起重要的作用[2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是進(jìn)行臨床研究前的必須過程，腹主動(dòng)脈縮窄因其經(jīng)濟(jì)實(shí)用性成為常用的心衰動(dòng)物模型，目前國內(nèi)外多采用大鼠建立心衰動(dòng)物模型，而制備腹主動(dòng)脈縮窄小鼠模型則鮮有報(bào)道，并且缺乏腹主動(dòng)脈縮窄后小鼠心功能的動(dòng)態(tài)變化的相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)對(duì)腹主動(dòng)脈縮窄的昆明小鼠分別培養(yǎng)2周、4周、6周、8周，得到不同發(fā)展階段的心衰小鼠模型，探討腹主動(dòng)脈縮窄小鼠在慢性心力衰竭發(fā)展過程中心臟結(jié)構(gòu)和功能的動(dòng)態(tài)變化和相互聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Vevo2100超高分辨率小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)(加拿大VisualSonics公司)，Rm6240型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性昆明小鼠(購自河南實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)60只，體質(zhì)量 (20±5)g。小鼠飼養(yǎng)于通風(fēng)暗室，以日光燈調(diào)節(jié)光照周期(12 h：12 h)，室溫保持在23℃～24℃。飼養(yǎng)3日后隨機(jī)分為模型組、假手術(shù)組和對(duì)照組。模型組組內(nèi)分為2周組、4周組、6周組和8周組，每組10只。模型組進(jìn)行腹主動(dòng)脈縮窄，假手術(shù)組只游離出腹主動(dòng)脈，不縮窄。對(duì)照組不做任何處理。

1.3 腹主動(dòng)脈縮窄小鼠模型制備

小鼠經(jīng)10%水合氯醛(0.03 ml/kg體重)麻醉后仰臥位固定于鼠板上。做腹部正中切口，玻璃分針游離腎動(dòng)脈分支以上的腹主動(dòng)脈，使其充分暴露并在其下方穿線。在腎動(dòng)脈分支上方0.5 cm處將5號(hào)注射針頭與腹主動(dòng)脈一同結(jié)扎，然后緩慢拔出針頭，使腹主動(dòng)脈縮窄50%左右。術(shù)后注射慶大霉素2.4×104U/(kg·d),持續(xù)3 d，預(yù)防感染。

1.4 心電圖測量

小鼠經(jīng)乙醚麻醉后固定于鼠板上，待小鼠清醒后，采用Rm6240型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)連續(xù)記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖5 min，測量心率(heart rate,HR)、R幅值、T幅值、ST段、PR間期、QT間期、QTc等。

1.5 超聲心動(dòng)圖檢查

小鼠胸部剃毛后在心臟乳頭肌水平行M型、B型超聲心動(dòng)圖成像檢測(探頭頻率為16 MHz)，記錄以下指標(biāo)：射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction, EF)、舒張末期室間隔厚度(interventricular septum thickness at end-diastole, IVSD)、左心室舒張末期后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness at end-diastole, LVPWD)、收縮末期室間隔厚度(interventricular septum thickness at end-systole, IVSS)、左心室收縮末期后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness at end-systole, LVPWS)、校正后的左心室質(zhì)量(left ventricular mass corrected, LV mass corrected)。

1.6 心臟HE染色

各組小鼠達(dá)到對(duì)應(yīng)周數(shù)后，經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉后，在劍突下做腹腔正中開口，快速取出心臟。將心臟用石蠟包埋制作切片，切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木精液和伊紅染色后常規(guī)脫水、透明、干燥、封片。顯微鏡下觀察各組心臟組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

假手術(shù)組和對(duì)照組相比，行為學(xué)變化、心電圖變化、超聲心動(dòng)圖變化以及組織病理學(xué)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.1 各組小鼠的行為學(xué)變化

與對(duì)照組和假手術(shù)組對(duì)比，模型組小鼠術(shù)后2周開始出現(xiàn)毛色發(fā)黃、無光澤、并進(jìn)行性加重。4周開始出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、活動(dòng)度差、煩躁不安、口唇發(fā)紺、尿少、尿黃等癥狀，并出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。4周組死亡1只，6周組死亡2只，8周組死亡5只。

2.2 各組小鼠的心電圖變化

模型組與對(duì)照組和假手術(shù)組相比，4周、6周、8周小鼠心電圖出現(xiàn)病理性J波(圖1)。2周、4周、6周、8周腹主動(dòng)脈縮窄小鼠的心率、R幅值、T幅值、ST段、PR間期、QT間期、QTc等數(shù)據(jù)差異均無顯著性。8周模型組鼠的R幅值減小(P<0.05)，與對(duì)照組相比有顯著差異(表1)。

Tab. 1 Comparison of ECG changes among

Fig. 1 Comparison of electrocardiogram among groups

2.3 各組小鼠的超聲心動(dòng)圖變化

模型組與對(duì)照組相比，僅2周小鼠出現(xiàn)了IVSS降低(P<0.05)，4周、6周、8周小鼠出現(xiàn)EF降低(P<0.05)和IVSD增加(P<0.05)，6周、8周小鼠出現(xiàn)LVPWD和LVPWS增加(P<0.05)，8周小鼠出現(xiàn)了LV mass corrected 降低(P< 0.05)。模型組與假手術(shù)組相比,僅2周小鼠出現(xiàn)IVSS降低，4周、6周和8周小鼠出現(xiàn)IVSD增加(P<0.05)，6周、8周小鼠出現(xiàn)EF降低(P<0.05)以及LVPWD、LVPWS均增加(P<0.05，表2)。

Tab. 2 Comparison of echocardiographyic changes among

2.4 各組小鼠心肌HE染色結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組小鼠心肌纖維增粗，排列紊亂，出現(xiàn)了心肌細(xì)胞壞死，隨著周數(shù)的增加而加劇(圖2)。

Fig. 2 HE staining of mouse heart(×20)A: Sham operation group; B: 2-week group; C: 4-week group; D: 6-week group; E: 8-week group

3 討論

隨著醫(yī)療技術(shù)的提高，對(duì)于心衰的治療水平也逐步提高，但是其死亡率依舊超過50%[3]。主動(dòng)脈狹窄是較為常見的先天性心臟大血管畸形，在常見的先天性心臟病中發(fā)生率較高，腹主動(dòng)脈縮窄是其主要形式。惡性和難治性高血壓是本病的主要特征，最終導(dǎo)致心力衰竭甚至死亡。此次采用腹主動(dòng)脈縮窄的方法制備后負(fù)荷增強(qiáng)的心衰模型，腹主動(dòng)脈狹窄可升高主動(dòng)脈壓，從而使后負(fù)荷增強(qiáng)，致左心室肥厚，擴(kuò)大，舒縮功能下降，最終形成心力衰竭[4,5]。此模型方法簡單，模型確切，成本較低，有助于觀察心衰的緩慢進(jìn)展，是研究心力衰竭病理生理學(xué)過程較為理想的小動(dòng)物模型[6]。

本實(shí)驗(yàn)中模型組小鼠出現(xiàn)行動(dòng)遲緩，活動(dòng)度差，煩躁不安等行為學(xué)改變，與文獻(xiàn)報(bào)道精神狀態(tài)差，活動(dòng)度下降相類似[7]，而對(duì)照組和假手術(shù)組行為表現(xiàn)正常，說明縮窄腹主動(dòng)脈所致心力衰竭是小鼠行為表現(xiàn)出現(xiàn)變化的原因。

體表心電圖是一種非常簡便實(shí)用的無創(chuàng)性檢查方法，為臨床多種心臟疾患提供依據(jù)。目前普遍認(rèn)為，J波是心室提前發(fā)生的復(fù)極波[8]，在心衰的發(fā)展過程中，J波的出現(xiàn)可能與心肌缺血有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和假手術(shù)組未出現(xiàn)病理性J波，而模型組小鼠術(shù)后4周開始出現(xiàn)病理性J波，且心肌缺血與本實(shí)驗(yàn)組織病理學(xué)表現(xiàn)相一致。有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明[9],在心肌肥厚、心力衰竭發(fā)展過程中,早期J 波幅值增大、變寬，之后幅值逐漸降低, 嚴(yán)重心力衰竭時(shí) J 波倒置,甚至與 T 波融合。在本實(shí)驗(yàn)中，2周模型組小鼠的J波幅值增大、變寬，至6周達(dá)到高峰，8周J波下降，但沒有明顯降低，甚至倒置的現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)心力衰竭小鼠的心電圖變化主要體現(xiàn)在J波的出現(xiàn)。這與他人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相類似，但對(duì)于T幅值的改變情況存在爭議[10]。本實(shí)驗(yàn)可能由于實(shí)驗(yàn)周數(shù)較短，未能體現(xiàn)出T幅值的變化，需要進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)8周模型組小鼠的R幅值出現(xiàn)增高的現(xiàn)象。有實(shí)驗(yàn)研究表明，R波振幅的增加可能與缺血時(shí)左心室腔的擴(kuò)張相關(guān)[11]，同時(shí)也預(yù)示了體液潴留的存在，這符合充血性心力衰竭小鼠模型的典型特征，并且心肌缺血與本實(shí)驗(yàn)組織病理學(xué)表現(xiàn)相一致。

超聲心動(dòng)圖能評(píng)估CHF患者的心功能狀態(tài), 是當(dāng)前診斷各種心臟疾病的主要輔助手段。本實(shí)驗(yàn)將各項(xiàng)指標(biāo)變化與心衰發(fā)展時(shí)間相關(guān)聯(lián)，從而對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)差異出現(xiàn)的前后順序進(jìn)行分析。 超聲心動(dòng)圖的改變最早出現(xiàn)于4周小鼠的IVSD升高和EF降低，隨后出現(xiàn)LVPWD和LVPWS的升高，最后出現(xiàn)LV mass corrected增加，說明了腹主動(dòng)脈縮窄首先影響了室間隔的組織結(jié)構(gòu)，使舒張末期室間隔增厚，同時(shí)導(dǎo)致EF初步降低，隨后影響了左心室后壁的組織結(jié)構(gòu)，使得左室后壁增厚、心臟的舒縮功能下降，從而導(dǎo)致EF進(jìn)一步降低，且由于左室的代償性肥厚出現(xiàn)左心室質(zhì)量增加，出現(xiàn)明顯的心衰現(xiàn)象。提示在心衰發(fā)展過程中出現(xiàn)了心室重構(gòu)，從而影響了心室結(jié)構(gòu)和功能[12]，與本實(shí)驗(yàn)組織病理學(xué)表現(xiàn)相一致。IVSS的顯著降低只存在于2周模型組小鼠與對(duì)照組和假手術(shù)組之間。這可能是因?yàn)楹筘?fù)荷增強(qiáng)，心臟處于代償期，心肌收縮增強(qiáng)，而心肌重構(gòu)不明顯，即室間隔增厚不明顯，導(dǎo)致收縮末期室間隔過度收縮，厚度減低。

在縮窄腹主動(dòng)脈所致后負(fù)荷增強(qiáng)的慢性心力衰竭小鼠心衰發(fā)展過程中，出現(xiàn)了心肌纖維的增粗，心肌細(xì)胞壞死且最先出現(xiàn)在室間隔和左心室后壁，導(dǎo)致二者增厚。此外，心臟的組織病理變化提示心肌存在缺血缺氧，缺血缺氧影響了心室早期的復(fù)極化過程，在心電圖中可表現(xiàn)為病理性J波，這與本次實(shí)驗(yàn)心電圖表現(xiàn)相一致。

綜上所述，小鼠腹主動(dòng)脈縮窄可以模擬心室肥厚-心衰的病理過程。心臟首先受到后負(fù)荷增強(qiáng)的影響，出現(xiàn)了EF降低，同時(shí)引起室間隔代償性肥厚。EF降低和室間隔增厚可以進(jìn)一步導(dǎo)致心肌缺血，病理性J波及R幅值增高的出現(xiàn)可能與其相關(guān)。隨后，左室后壁代償性肥厚，左室質(zhì)量增加，影響心臟舒縮功能，EF進(jìn)一步降低，出現(xiàn)明顯的心衰現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究了腹主動(dòng)脈縮窄小鼠在向心力衰竭發(fā)展的過程中心臟結(jié)構(gòu)和功能的動(dòng)態(tài)變化以及相互聯(lián)系。有利于判斷腹主動(dòng)脈縮窄所致心力衰竭的進(jìn)展情況，為臨床外科治療腹主動(dòng)脈狹窄后的內(nèi)科治療以及預(yù)測患者預(yù)后提供依據(jù)。