陳旭娥， 馬 婷， 盛 良， 王文雯， 李 季

(貴州省人民醫(yī)院皮膚科， 貴陽(yáng) 550002)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種以大量自身抗體產(chǎn)生并累及多種臟器為特點(diǎn)的自身免疫性疾病[1]。SLE治療以糖皮質(zhì)激素聯(lián)合免疫抑制劑為主，盡管取得較好臨床療效，但也帶來(lái)嚴(yán)重不良反應(yīng)，因此亟需探索安全有效的治療策略。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是一組具有免疫抑制功能的CD4+T淋巴細(xì)胞，對(duì)維持機(jī)體免疫應(yīng)答穩(wěn)態(tài)和免疫耐受方面具有重要作用；新近發(fā)現(xiàn)的輔助性T細(xì)胞17(Th17)是一組重要促炎性細(xì)胞，介導(dǎo)機(jī)體炎性反應(yīng)。研究已證實(shí)，Th17與Treg間失衡與SLE等自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)；糾正Th17/Treg失衡狀態(tài)，可減輕SLE炎癥損害[2]。

IL-21是一種新型細(xì)胞因子，由活化T細(xì)胞、NK細(xì)胞分泌，刺激B細(xì)胞生發(fā)中心形成、分化成漿細(xì)胞并分泌自身抗體。研究證實(shí)，阻斷IL-21生物學(xué)功能，對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病有明顯療效[3]。但其對(duì)SLE治療效果及作用機(jī)制尚不清楚。MRL/lpr小鼠是1979年由Murphy和Roths首次建立的狼瘡模型鼠，由LG/J、ARK/J、C3H/Di和C57BL/6J品系小鼠交配產(chǎn)生，表現(xiàn)為Fas基因隱性突變，T細(xì)胞過(guò)度增生、全身淋巴結(jié)腫大，自身免疫應(yīng)答亢進(jìn)；由于MRL/lpr狼瘡小鼠的血清學(xué)與人類SLE極為相似，因此常作為研究紅斑狼瘡的理想動(dòng)物模型。本研究應(yīng)用IL-21單克隆抗體干預(yù)MRL/lpr狼瘡小鼠，觀察小鼠免疫學(xué)指標(biāo)、Th17/Treg相關(guān)細(xì)胞因子、腎功能指標(biāo)等變化，以探討IL-12單克隆抗體治療SLE的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取12周齡、雌性MRL/lpr小鼠20只、同性別同年齡C57BL/6小鼠10只，體重均為17～24 g，購(gòu)于廣東實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及干預(yù)措施

用隨機(jī)數(shù)字表達(dá)法將20只MRL/lpr狼瘡鼠隨機(jī)分為模型組、治療組，每組10只；同時(shí)選取10只C57BL/6小鼠作為正常組。治療組每周一上午10點(diǎn)腹腔注射IL-21單克隆抗體(每只100 μg)，每周1次，連續(xù)干預(yù)8周；模型組及正常組小鼠相同時(shí)間給予等量生理鹽水腹腔注射(每只100 μg)。三組小鼠均于治療結(jié)束后一周處死。

1.3 主要試劑

IL-21單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)eBioscience公司；兔抗IL-21多克隆抗體購(gòu)于R&D公司；IL-17A、TGF-β1 ELISA試劑盒購(gòu)于eBioscience公司；小鼠抗雙鏈DNA(ds-DNA)ELISA試劑盒、小鼠抗核抗體(ANA)ELISA檢測(cè)試劑盒、小鼠血清肌酐ELISA試劑盒、小鼠血清尿素氮ELISA檢測(cè)試劑、考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于貴州吉?jiǎng)?chuàng)生物技術(shù)有限公司。

1.4 一般情況觀察

觀察各組小鼠的毛色光澤、脫毛情況、活動(dòng)狀態(tài)及頸部、腋下、腹股溝淋巴結(jié)腫大的情況。

1.5 蛋白免疫印跡(Western blot)

每50 mg腎組織加入500 μl蛋白裂解液，靜置30 min后，離心并收集上清液，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。常規(guī)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后添加一抗：GAPDH(1∶1 000)、IL-21(1∶500)，置于4℃孵育過(guò)夜；加入二抗，室溫下放置1 h，洗膜、顯影，分析IL-21與GAPDH的總吸光度比值。

1.6 小鼠24 h尿蛋白水平檢測(cè)

參照說(shuō)明書(shū)、運(yùn)用考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)試劑，采用生物化學(xué)法檢測(cè)三組小鼠24 h尿蛋白水平。

1.7 小鼠血清免疫學(xué)指標(biāo)、腎功能及炎癥細(xì)胞因子水平檢測(cè)

處死小鼠后摘眼球取血，靜置30 min，2 500 r/min離心15 min，取上層血清，采用ELISA法檢測(cè)三組小鼠血清中抗ds-DNA抗體、ANA抗體、血尿素氮、肌酐及炎癥細(xì)胞因子IL-17A、TGF-β1水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況結(jié)果比較

正常組小鼠皮毛和活動(dòng)正常，頸部、腋下、腹股溝未見(jiàn)明顯腫大的淋巴結(jié)；模型組小鼠皮毛晦暗、缺乏光澤，頭部皮膚毛發(fā)缺損，腫大淋巴結(jié)數(shù)量明顯增多；與模型組比較，治療組小鼠毛色、皮損明顯減輕，均未見(jiàn)毛發(fā)缺損，腫大淋巴結(jié)數(shù)量明顯減少。

2.2 小鼠腎臟IL-21蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，正常組小鼠腎臟組織IL-21低表達(dá)，模型組小鼠腎臟組織IL-21水平較正常組顯著升高(P<0.01)；使用IL-21單克隆抗體治療8周后，治療組小鼠腎臟IL-21蛋白水平較模型組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1，圖1)。

Tab. 1 Levels of IL-21 protein in the kidney tissues and urine protein in three groups of n=10)

Fig. 1 The protein level of IL-21 in the kidney tissues of three groups mice detected by Western blot

2.3 小鼠24小時(shí)尿蛋白檢測(cè)結(jié)果

正常組小鼠24 h尿蛋白檢測(cè)結(jié)果陰性，而模型組小鼠24 h尿蛋白明顯升高(P<0.01)。IL-21單克隆抗體干預(yù)8周后，治療組小鼠24 h尿蛋白水平較模型組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。模型組、治療組及正常組小鼠24 h尿蛋白生物化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 小鼠血清自身抗體(抗ds-DNA抗體、ANA)檢測(cè)結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠血清抗ds-DNA抗體、ANA水平顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。經(jīng)IL-21抗體治療8周后，與模型組比較，治療組血清抗ds-DNA、ANA水平顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表2)。

Tab. 2 Serum level of anti-ds-DNA antibody and ANA in three groups of mice by ELISA (pg/ml, n=10)

2.5 小鼠血清尿素氮、肌酐檢測(cè)結(jié)果

各組小鼠血清尿素氮、肌酐檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。與正常組比較，模型組尿素氮、肌酐水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，治療組尿素氮、肌酐水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Tab. 3 Serum level of serum urea nitrogen and creatinine in three groups of mice by ELISA n=10)

2.6 小鼠血清Th17/Treg相關(guān)炎癥細(xì)胞因子IL-17A、TGF-β1檢測(cè)結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠血清IL-17A水平明顯升高(P<0.01)、而TGF-β1水平顯著下降(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-21抗體治療8周后，治療組血清IL-17A水平較模型組顯著降低(P<0.01)，而TGF-β1水平反而增加(P< 0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三組小鼠血清Th17/Treg相關(guān)炎癥細(xì)胞因子IL-17A和TGF-β1水平檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

Tab. 4 Serum levels of inflammatory cytokines of IL-17A and TGF-β1 in three groups of mice(pg/ml， n=10)

3 討論

目前認(rèn)為系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機(jī)制可能與遺傳及免疫失調(diào)有關(guān)[4]，B細(xì)胞功能亢進(jìn)是發(fā)病關(guān)鍵環(huán)節(jié)。若治療不當(dāng)，部分患者將發(fā)展至腎功能衰竭，甚至危及生命[5]。因此，抑制自身抗體產(chǎn)生始終是SLE治療領(lǐng)域研究焦點(diǎn)[6]。

腎臟受損是SLE最常見(jiàn)的并發(fā)癥，發(fā)病率高且難以治愈，其臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)為尿蛋白定量、血清肌酐、尿素氮水平，SLE活動(dòng)度評(píng)價(jià)指標(biāo)常用抗ds-DNA、ANA水平。為了探討IL-21單克隆抗體在SLE治療中的價(jià)值，本研究對(duì)治療組小鼠腹腔注射IL-21單克隆抗體，治療8周后血清抗ds-DNA、ANA、尿素氮、肌酐、尿蛋白定量均明顯下降，提示治療后狼瘡活動(dòng)性降低、自身抗體減少、腎功能改善。Bubier等[7]通過(guò)IL-21R-Fc段融合蛋白封閉IL-21R，也取得較好療效。Zhang等[8]使用IL-21R中和抗體，有效改善NZB/NZW小鼠腎臟、淋巴結(jié)及脾臟組織病理學(xué)狀態(tài)?？傊?，IL-21生物學(xué)活性阻斷在SLE治療中可抑制自身抗體產(chǎn)生、減緩腎臟受損這一觀點(diǎn)已被眾多研究證實(shí)，但其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步明確。

IL-21是2000年發(fā)現(xiàn)的I型細(xì)胞因子家族成員，與IL-21R結(jié)合并啟動(dòng)JAK/STAT信號(hào)通路，促進(jìn)B細(xì)胞分化為分泌免疫球蛋白的自身反應(yīng)性漿細(xì)胞(Ig-secreting autoreactive plasma cell)。JAK/STAT信號(hào)通路廣泛參與免疫調(diào)節(jié)，多種細(xì)胞外信號(hào)刺激引起JAKs的激活，激活的JAKs促使酪氨酸殘基磷酸化，進(jìn)而使STATs磷酸化而被活化，激活的STATs移位到細(xì)胞核，啟動(dòng)目的基因表達(dá),發(fā)揮生物學(xué)作用[9]。研究已證實(shí)，JAK/STAT信號(hào)通路異常激活與SLE的皮膚損害、腎臟炎癥及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)[10]。IL-21與其受體結(jié)合促進(jìn)IL-21/STAT3自分泌循環(huán)，導(dǎo)致STAT3持續(xù)激活，誘導(dǎo)ROR-γ表達(dá)及Th17細(xì)胞分化[11]；而STAT3與Treg細(xì)胞Foxp3基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子上特定部位結(jié)合抑制Foxp3表達(dá)，誘導(dǎo)Treg向Th17轉(zhuǎn)化[12]。Th17和Treg相互制約、功能拮抗[13]，重塑Th17/Treg免疫平衡在SLE治療中療效明確[14]。Th17細(xì)胞主要分泌IL-17A、IL-21、IL-22等因子，IL-21促進(jìn)T細(xì)胞向Th17分化，起正反饋促進(jìn)作用。IL-21、BAFF (B-cell activating factor)和IL-17共同促進(jìn)B細(xì)胞生發(fā)中心形成、分泌自身抗體。相反，Treg通過(guò)釋放免疫抑制因子IL-10、TGF-β，抑制免疫反應(yīng)，維持免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。研究已證實(shí)檢測(cè)血清IL-17A、TGF-β1水平，可側(cè)面體現(xiàn)Th17/Treg的分化傾向及平衡狀態(tài)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)MRL/lpr狼瘡小鼠血清中炎癥因子IL-17A水平較高、TGF-β1濃度較低，進(jìn)一步證實(shí)了SLE發(fā)病機(jī)制中Th17/Treg細(xì)胞處于失衡狀態(tài)；IL-21單克隆抗體治療后，治療組小鼠外周血IL-17A水平下降、TGF-β1升高；傾向于糾正IL-17A、TGF-β1紊亂狀態(tài)，同時(shí)伴隨狼瘡臨床表現(xiàn)緩解，自身異常免疫應(yīng)答得到部分改善。綜上所述，IL-21單克隆抗體在SLE治療領(lǐng)域有較好潛力，其作用機(jī)制可能是誘導(dǎo)重建Th17/Treg細(xì)胞相關(guān)炎癥因子平衡，從而減輕SLE臟器損害。本研究對(duì)IL-21單克隆抗體治療SLE進(jìn)行初步探討，為SLE治療研究提供新思路，但其確切免疫學(xué)機(jī)制尚不清楚，值得進(jìn)一步深入研究。