歐陽(yáng)昕， 李 清， 肖愛(ài)嬌△， 陳明人

(1. 江西中醫(yī)藥大學(xué)岐黃國(guó)醫(yī)書(shū)院， 南昌 330004； 2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院， 南昌 330004； 3. 江西中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，南昌 330004 )

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemia encephalopathy,HIE)是指圍生期窒息引起的部分或完全缺氧、腦血流減少或暫停而導(dǎo)致胎兒或新生兒腦損傷[1]。從發(fā)病機(jī)制上來(lái)說(shuō)，該病涉及的病理生理過(guò)程十分復(fù)雜，有許多相互關(guān)聯(lián)的機(jī)制在起作用，其中氧化應(yīng)激為其重要的發(fā)病機(jī)制之一[2，3]。它會(huì)使活性氧產(chǎn)生，且迅速增加并抵抗抗氧化劑的防御[4]，造成超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性降低，丙二醛(malondialdehyd,MDA)含量增加[5，6]，從而引起腦組織損傷。從治療上而言，目前對(duì)于該病尚未形成統(tǒng)一的治療方案，最新的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明艾灸能夠減輕新生小鼠缺氧缺血性腦損傷[7]。然而，艾灸能否通過(guò)提高抗氧化應(yīng)激能力，達(dá)到減輕新生小鼠缺氧缺血性腦損傷、改善行為學(xué)表現(xiàn)的作用機(jī)制還不十分清楚。為此，本研究在前述研究[7-9]的基礎(chǔ)上，探討艾灸對(duì)腦組織中SOD蛋白表達(dá)和MDA含量的影響，測(cè)試小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)和腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，闡明艾灸治療新生小鼠HIE的作用機(jī)制，提供臨床應(yīng)用艾灸防治新生兒HIE實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康ICR小鼠16只，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)為SCXK(湘)2013-0004。孕21 d，待其自然分娩，使用新生小鼠106只，雌雄不限。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，所有鼠均在室溫(24±2)℃、相對(duì)濕度(50±5) %、光照周期(11±1) h 的動(dòng)物房中飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器

1.3 動(dòng)物分組及HIE新生小鼠模型制備

將所有新生小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和艾灸組。假手術(shù)組(23只)只做頸部切口，不做缺血、缺氧處理；模型組(46只)在頸部切開(kāi)后分離、閉合左側(cè)頸總動(dòng)脈，并做缺氧處理；艾灸組(37只)同模型組，并施予艾灸治療。關(guān)于制備HIE新生小鼠模型的具體方法，詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[7-9]。

1.4 艾灸治療

造模后2 h艾灸組開(kāi)始艾灸治療：用直徑4 mm×長(zhǎng)100 mm的艾條，在“大椎”穴施行溫和灸(距穴位2 cm左右)，每天1次，每次35 min，連續(xù)4 d (即造模后2 h, 24 h, 48 h 和72 h)。該穴定位參考文獻(xiàn)[10]中小鼠的腧穴定位：第7頸椎與第1胸椎棘突間，背部正中。假手術(shù)組和模型組新生鼠均不予艾灸治療。

1.5 觀(guān)察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.5.1 行為學(xué)測(cè)試 于造模后1 d和3 d，參考文獻(xiàn)[6]對(duì)各組小鼠進(jìn)行測(cè)試。

1.5.2 腦組織病理檢查 于造模后3 d，各組分別取5只鼠，觀(guān)察腦組織形態(tài)。小鼠麻醉后迅速取腦，數(shù)碼相機(jī)拍照，隨后切片、HE染色、封片，最后在鏡下(×200)觀(guān)察患側(cè)腦大腦皮質(zhì)形態(tài)結(jié)構(gòu)。HE染色具體操作方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[7]。

1.5.3 腦組織SOD2蛋白檢測(cè) 于造模后3 d，各組分別取4只鼠左側(cè)大腦皮質(zhì)采用Western blot技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。給予小鼠異氟醚吸入麻醉后迅速在冰上取腦，參見(jiàn)文獻(xiàn)[11]檢測(cè)SOD2蛋白表達(dá)水平。

1.5.4 腦組織MDA含量測(cè)定 于造模后3 d，各組分別取6只鼠左側(cè)大腦皮質(zhì)采用分光光度法進(jìn)行測(cè)定。給予小鼠異氟醚吸入麻醉后迅速在冰上取腦，參見(jiàn)文獻(xiàn)[11]測(cè)定MDA水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 艾灸對(duì)缺氧缺血性腦損傷新生小鼠行為學(xué)測(cè)試結(jié)果的影響

翻正反射：造模后1 d，模型組和艾灸組小鼠均出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙，表現(xiàn)為翻正反射時(shí)間較假手術(shù)組延長(zhǎng)；造模后3 d，假手術(shù)組、模型組和艾灸組小鼠翻正反射時(shí)間均縮短，但模型組比假手術(shù)組長(zhǎng)(P<0.05)，艾灸組比模型組短(P<0.05，表1)。

在教育隨筆的寫(xiě)作中沉淀教育智慧。一個(gè)班主任的專(zhuān)業(yè)智慧從實(shí)踐中來(lái)，從閱讀中來(lái)，從思考中來(lái)，更從寫(xiě)作中來(lái)。李鎮(zhèn)西說(shuō)過(guò)：“實(shí)踐是寫(xiě)作的源泉，閱讀是寫(xiě)作的基礎(chǔ)，思考是寫(xiě)作的靈魂。”反之，寫(xiě)作監(jiān)督實(shí)踐，寫(xiě)作逼迫閱讀，寫(xiě)作催化思考。寫(xiě)作調(diào)和實(shí)踐、閱讀、思考，寫(xiě)作生發(fā)智慧。寫(xiě)是做的監(jiān)督員，當(dāng)我們和學(xué)生談話(huà)，給學(xué)生開(kāi)班會(huì)時(shí)，如果想著要把這件事如實(shí)地記錄下來(lái)，那一定會(huì)非常謹(jǐn)慎，話(huà)說(shuō)得合適與否，會(huì)不會(huì)傷到學(xué)生的自尊，班會(huì)的策劃是否妥當(dāng)，都會(huì)仔細(xì)斟酌。

Tab. 1 Comparison of righting reflex of mice among three groups (s，

趨地反射：造模后1 d，模型組和艾灸組小鼠趨地反射時(shí)間較假手術(shù)組延長(zhǎng)；造模后3 d，假手術(shù)組、模型組和艾灸組小鼠趨地反射時(shí)間均縮短，但模型組比假手術(shù)組長(zhǎng)(P<0.05)，艾灸組比模型組短(P<0.05，表2)。

Tab. 2 Comparison of geotaxis reflex of mice among three groups (s，

懸崖躲避試驗(yàn)：造模后1 d，模型組和艾灸組小鼠懸崖躲避試驗(yàn)時(shí)間較假手術(shù)組延長(zhǎng)；造模后3 d，假手術(shù)組、模型組和艾灸組小鼠懸崖躲避試驗(yàn)時(shí)間均縮短，但模型組比假手術(shù)組長(zhǎng)(P<0.05)，艾灸組比模型組短(P<0.05，表3)。

Tab. 3 Comparison of cliff avoidance reaction of mice among three groups (s，

抓力試驗(yàn)：造模后1 d，模型組和艾灸組小鼠抓力試驗(yàn)時(shí)間較假手術(shù)組縮短；造模后3 d，假手術(shù)組、模型組和艾灸組小鼠抓力試驗(yàn)時(shí)間均延長(zhǎng)，但模型組比假手術(shù)組短(P<0.05)，艾灸組比模型組長(zhǎng)(P<0.05，表4)。

Tab. 4 Comparison of grip ability of mice among three groups (s，

2.2 艾灸對(duì)缺氧缺血性腦損傷新生小鼠腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 肉眼觀(guān)察 假手術(shù)組：腦組織紅潤(rùn)，腦溝及腦回清晰；模型組：左側(cè)腦組織蒼白、出現(xiàn)液化，腦溝變淺、腦回增寬；艾灸組：左側(cè)腦組織出現(xiàn)小面積梗死灶，腦組織較紅潤(rùn)，腦溝及腦回較清晰(圖1)。

Fig. 1 Gross observation of brain morphological structure among three groups of mice Dotted frame indicated injury sites

2.2.2 鏡下觀(guān)察 假手術(shù)組：腦組織細(xì)胞排列致密整齊；模型組：梗死側(cè)腦組織細(xì)胞大量變性壞死、脫落，周?chē)g隙擴(kuò)大；艾灸組：梗死側(cè)腦組織細(xì)胞排列較致密整齊(圖2)。

Fig. 2 HE staining results of brain morphological structure among three groups of mice(Scale bar=50 μm) Arrows indicated injury sites

2.2.3 艾灸對(duì)缺氧缺血性腦損傷新生小鼠腦組織SOD2蛋白表達(dá)和MDA含量的影響 從圖中可以看出，GAPDH和SOD2蛋白分別于分子量標(biāo)準(zhǔn)的37 kDa、25 kDa處出現(xiàn)清晰的條帶。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，模型組小鼠腦組織SOD2蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯少于假手術(shù)組(P<0.05)，而艾灸組小鼠腦組織SOD2蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著多于模型組(P<0.05，圖3，表5)。

從表5可以看出，模型組小鼠腦組織MDA的含量高于假手術(shù)組，而艾灸組小鼠腦組織MDA的含量顯著低于模型組(P<0.05，表5)。

Fig. 3 The expressions of SOD2 protein in brain tissues of mice detected by Western blot among three groups1: Sham group; 2: Model group; 3: Moxibustion group

Tab. 5 Comparison of the expressions of SOD2 protein and the content of MDA in brain tissues of mice among three groups

3 討論

新生兒缺氧缺血性腦病屬于難治的腦損傷疾病，涉及群體很大，據(jù)最新的資料統(tǒng)計(jì)，在發(fā)達(dá)國(guó)家，該病的發(fā)病率約為1.5‰[12]，而在發(fā)展中國(guó)家，該病的發(fā)病率還要高很多，約為10‰～20‰[12]。此外，該病還具有較高的致死率和致殘率[13，14]，這不僅嚴(yán)重影響了患兒的康復(fù)成長(zhǎng)，而且會(huì)造成家庭和國(guó)家繁重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會(huì)壓力。因此，加強(qiáng)研究治療新生兒HIE具有重要的意義。

對(duì)于該病的治療，西醫(yī)多采用低溫療法和高壓氧療法等[15-18]，但是這些治療方法都具有一定的副作用，如許多患者(足月產(chǎn)低體重兒以及早產(chǎn)兒)并不適合用低溫療法[15，16]，且接受低溫治療的患兒中仍有40%～50%死亡或伴有嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常[17]；高壓氧療法有可能出現(xiàn)晶體后纖維增生癥[18]等副作用。此外，潘友燦等[19]也指出，西醫(yī)對(duì)缺氧缺血性腦病的有效治療方案有限，因此替代療法受到越來(lái)越多的關(guān)注。

中醫(yī)作為西方醫(yī)學(xué)重要的替代療法，其中的艾灸療法因具有簡(jiǎn)、便、廉、效、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)，而被人們廣泛接受使用。它是以艾熱刺激體表穴位或特定部位，發(fā)揮著溫通經(jīng)脈、行氣活血等作用，在防治心腦血管疾病中發(fā)揮著重要作用[20]。在腦病的治療中，“歷代醫(yī)家素有病變?cè)谀X首取督脈之說(shuō)”[21]。而大椎穴為督脈上的要穴，具有調(diào)節(jié)手足陽(yáng)經(jīng)氣血和補(bǔ)益腦髓等作用，因此本課題組選取位于督脈上的大椎穴對(duì)HIE新生小鼠進(jìn)行艾灸治療。值得注意的是，雖然臨床上未見(jiàn)有關(guān)艾灸治療新生兒HIE的公開(kāi)報(bào)道，但本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)艾灸能夠減輕HIE新生小鼠腦損傷[7]。本次實(shí)驗(yàn)研究觀(guān)察到模型組小鼠翻正反射、趨地反射、懸崖躲避試驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)，抓力試驗(yàn)時(shí)間減短，腦組織細(xì)胞大量脫落，表明模型組小鼠存在感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)功能異常，腦組織損傷程度較重,與文獻(xiàn)[22]報(bào)道相似；經(jīng)艾灸治療后，該組小鼠翻正反射、趨地反射、懸崖躲避試驗(yàn)時(shí)間縮短，抓力試驗(yàn)時(shí)間增長(zhǎng)，腦組織細(xì)胞排列較整齊，表明艾灸組小鼠感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)功能得到改善，腦組織損傷程度較輕。這就說(shuō)明艾灸可能對(duì)新生兒HIE能起到一定的治療作用，因而深入探討艾灸治療新生兒HIE的作用機(jī)制具有重要的意義。

新生兒缺氧缺血性腦損傷發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜，涉及細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等[12]，其中氧化應(yīng)激為重要的發(fā)病機(jī)制之一[2，3]。當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生大量氧自由基，這些物質(zhì)會(huì)使細(xì)胞膜的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生過(guò)多的脂質(zhì)過(guò)氧化物，從而破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致腦損傷。SOD是人體內(nèi)十分重要的抗氧化酶，分布于全身各組織中，主要有3種類(lèi)型：SOD1分布在胞漿和血漿，SOD2分布于線(xiàn)粒體，胞外SOD分布在細(xì)胞間隙。SOD具有清除自由基的作用，其活性的高低反映了機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱。一般來(lái)說(shuō)，SOD與超氧陰離子反應(yīng)形成過(guò)氧化氫，再經(jīng)過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶轉(zhuǎn)變成水，從而使自由基清除，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。因此，SOD也被看作為活性氧防御的第一線(xiàn)。MDA是氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，可以作為過(guò)氧化產(chǎn)物的標(biāo)志物。有研究報(bào)道，新生鼠缺氧缺血性腦損傷發(fā)生后腦組織中MDA含量增加，而SOD活性下降[5，6]。林才等[23]研究發(fā)現(xiàn)，HIE患兒體內(nèi)自由基含量增多、SOD蛋白水平降低。由此推測(cè)，HIE新生小鼠體內(nèi)SOD蛋白水平降低、MDA含量增高。

根據(jù)以上的研究成果，本課題組提出如下假設(shè)：艾灸減輕新生小鼠缺氧缺血性腦損傷、改善行為學(xué)表現(xiàn)，可能與增加腦組織中的SOD2蛋白的表達(dá)、降低腦組織中的MDA的含量有關(guān)。為驗(yàn)證這一假說(shuō)，我們進(jìn)行了大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。在實(shí)驗(yàn)研究中，將小鼠隨機(jī)分為三組。一是假手術(shù)組，該組小鼠腦組織中的SOD2蛋白表達(dá)量和MDA的含量均正常；二是模型組，相比于假手術(shù)組，該組小鼠腦組織中的SOD2蛋白表達(dá)量減少，而MDA的含量增高；三是艾灸組，相比于模型組，該組小鼠腦組織中的SOD2蛋白表達(dá)量增多，而MDA的含量顯著降低。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)艾灸治療后，機(jī)體抗氧化酶SOD2表達(dá)增多，MDA的含量減少，抗氧化能力增強(qiáng)，從而緩解了氧化應(yīng)激，達(dá)到了治療效果。

綜上，本研究表明，艾灸能減輕HIE新生小鼠腦損傷、改善行為學(xué)表現(xiàn)，其作用可能與其增加腦組織SOD2蛋白的表達(dá)、降低MDA含量，提高抗氧化應(yīng)激能力有關(guān)。這一研究結(jié)果為艾灸在新生兒HIE臨床應(yīng)用提供了科學(xué)線(xiàn)索，有助于促進(jìn)艾灸在新生兒HIE臨床中的應(yīng)用。