宋佳玉， 郭 敬， 姜春明，3△

(1. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院新生兒科， 黑龍江 哈爾濱 150001； 2. 阜新市第二人民醫(yī)院新生兒科， 遼寧 阜新 123000；3. 珠海市婦幼保健院新生兒科， 廣東 珠海 519060)

內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁的一種成分，新生兒免疫力低，內(nèi)毒素血癥仍然是新生兒期危重癥及造成死亡的重要原因。既往研究提出內(nèi)毒素可能通過以下幾個方面引起心肌損傷：Toll樣受體的異常表達、體內(nèi)一氧化氮含量增加、促炎細胞因子的過度釋放、氧化應(yīng)激反應(yīng)異常激活、細胞內(nèi)能量代謝異常、腺苷受體活性降低、心肌細胞凋亡等[1]。我們研究發(fā)現(xiàn)，CaSR的激活可促進內(nèi)毒素所誘導(dǎo)的心肌損傷，這與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激和自噬途徑的上調(diào)有關(guān)[2]，然而相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑尚不清楚。因此，本實驗通過建立內(nèi)毒素新生大鼠心肌損傷模型，觀察CaSR及JNK在內(nèi)毒素所致的心肌損傷中的表達變化，揭示其在內(nèi)毒素所誘導(dǎo)的心肌損傷中的作用及可能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

健康2-3日齡SPF級Wistar新生大鼠48只，雌雄不限，由吉林省長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；內(nèi)毒素(LPS)(L-2880)購自sigma公司；SC-211006和SC-207394購自santa cruz biotechnology,lnc；SP600125購自碧云天生物技術(shù)研究所；CaSR兔多抗(alomone labs，ACR-004)；JNK兔多抗(CST，9258)；GAPDH 鼠單抗(天德悅，TDY042)；光學(xué)顯微鏡(日本 OLYMPUS)；ABI 7500型熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)。

1.2 內(nèi)毒素新生大鼠模型的建立及分組

Wistar大鼠隨機分成6組，每組8只：(1)對照(Control)組：腹腔注射與用藥組等體積的生理鹽水；(2)內(nèi)毒素(LPS)組：將LPS用1 ml 0.9%NaCl溶解后，按照5 mg/kg腹腔注射入體內(nèi)；(3)LPS+CaSR激動劑(SC-211006 )組：腹腔注射LPS 1 h后，再注射SC-211006(0.02 ml/g)；(4)LPS+CaSR抑制劑(SC-207394)組：腹腔注射LPS 1 h后，再注射SC-207394(0.02 ml/g)；(5)LPS+JNK抑制劑(SP600125)組：腹腔注射LPS 1 h后，再注射SP600125(30 mg/kg)；(6)LPS+ SC-207394+ SP600125組：腹腔注射LPS 1 h后，注射SC-207394(0.02 ml/g)，間隔1 h，再注射SP600125(30 mg/kg)。

1.3 標(biāo)本的采集

1.3.1 血清標(biāo)本：腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)將大鼠完全麻醉，直扎心臟取約1～2 ml的血液，離心后取出血清至EP管內(nèi)，標(biāo)記后，置于-20℃凍存。

1.3.2 心肌標(biāo)本：取出心臟組織，用冰鹽水沖洗，解剖出心室部分，將其分為兩份。一份用10%甲醛溶液固定，標(biāo)記后置于4℃存放，待用光鏡觀察；另一份置于冷凍管內(nèi)，標(biāo)記后在-80℃下凍存，用于Western blot實驗。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 光鏡下觀察心肌形態(tài)：將甲醛溶液固定后的心室標(biāo)本常規(guī)脫水，石蠟包埋，切成厚約4 μm的薄片，再經(jīng)二甲苯脫蠟，蘇木素和伊紅染色，乙醇逐級脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后，用光鏡觀察并攝片。

1.4.2 LDH含量測定：取眼球血約2 ml，3 000 r/min 4℃離心，取上層血清，按試劑盒說明操作，測定LDH含量。

1.4.3 Real Time PCR 檢測IL-6的表達：用提取試劑盒從血清標(biāo)本中提取總RNA后，取5 μl RNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳以檢測RNA的完整性。用DNase Ⅰ試劑盒消化提取后的RNA， HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。再以2 μl cDNA為模板在20 μl反應(yīng)體系中依次加入2×UltraSYBR Mixture及靶基因IL-6的上下游引物，用熒光定量PCR儀器進行擴增，反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃10 min，(變性95℃15 s，退火/延伸60℃1 min)×45個循環(huán)。采用2-△△CT法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析，同時以GAPDH作為內(nèi)參照。

1.4.4 Western blot檢測CaSR和JNK的蛋白表達情況：將心肌標(biāo)本剪碎，加入含PMSF的RIPA裂解液，勻漿后冰上孵育20 min，4℃條件下，以13 000 r/min離心20 min，取上清液分裝，用BCA法測定蛋白濃度。調(diào)整蛋白濃度后煮沸變性5 min，進行10%SDS-PAGE凝膠電泳，使目的蛋白分離，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NC膜上，TBS洗膜。在室溫下，把膜置于5%脫脂牛奶中封閉1 h，剪下所需的片段，將其置于一抗稀釋液(CaSR兔多抗1∶1 000稀釋液；JNK兔多抗1∶4 000稀釋液)中，4℃過夜。孵育結(jié)束后，用TBST洗膜5次，再按抗體種屬不同，將堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗稀釋液放置在不同膜內(nèi)，室溫輕搖，TBST洗膜。把膜置于顯色液中，曝光顯影，再定影。同時用GAPDH鼠抗體作為內(nèi)參照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 心肌形態(tài)學(xué)變化

光鏡下可見Control組心肌細胞正常，細胞核清晰可見；LPS組心肌細胞腫脹，空泡變性，個別細胞出現(xiàn)核固縮，細胞間質(zhì)內(nèi)可見炎性細胞浸潤；LPS+SC-211006 組心肌細胞明顯腫脹，空泡變性，可見少量凋亡細胞，部分細胞核固縮，間質(zhì)內(nèi)炎性細胞浸潤；LPS+SC-207394組：心肌細胞腫脹，發(fā)生輕度空泡變性，部分細胞核固縮；LPS+SP600125組：部分心肌細胞腫脹，空泡變性較前減輕，部分細胞核固縮；LPS+SC-207394+ SP600125組：心肌細胞腫脹明顯減輕，空泡變性也明顯減少(圖1)。

Fig. 1 HE staining in the myocardium of rats(×200)1: Control group; 2: LPS group； 3: LPS +SC-211006 group; 4: LPS+SC-207394 group; 5: LPS + SP600125 group; 6: LPS+SC-207394+SP600125 group

2.2 內(nèi)毒素所致的LDH含量的變化

與對照組比較，LPS組LDH含量顯著增加(P<0.05)；給予SC-211006后LDH含量為(76.8± 6.4)，高于LPS組(P<0.05)；給予SC-207394和SP600125后LDH含量分別為53.5±3.2和50.6±5.5，均明顯低于LPS組(P<0.05)；LPS+SC-207394+ SP600125組LDH含量為41.4±2.9，進一步明顯低于LPS組(P<0.05，表1)。

2.3 血清IL-6 Real Time PCR檢測結(jié)果

與對照組比較，LPS組IL-6的 mRNA表達水平顯著增加(P<0.05)；與LPS組比較，給予SC-211006后IL-6的mRNA表達明顯高于LPS組(P<0.05)；給予SP600125后IL-6的mRNA表達值為(1.597±0.086)，明顯低于LPS組和SC-207394組(P<0.05)；LPS+SC-207394+ SP600125組IL-6的mRNA表達值為(1.558±0.076)，進一步明顯低于LPS組(P<0.05，表1)。

Tab. 1 The changes of LDH content and levels of IL-6 n=8)

2.4 心肌組織中CaSR蛋白表達

與對照組相比，LPS組CaSR蛋白表達增加(P<0.05)；給予SC-211006后，CaSR的蛋白表達水平高于LPS組(P<0.05)；給予SC-207394和SP600125后，CaSR的蛋白表達量均低于LPS組(P<0.05)；LPS+SC-207394+ SP600125組CaSR的蛋白表達量降到最低，明顯低于LPS組(P<0.05，圖2)。

Fig. 2 The expression of CaSR protein analyzed by Western blotA: control group; B: LPS group; C: LPS +SC-211006 group; D: LPS+SC-207394 group; E: LPS + SP600125 group; F: LPS+SC-207394+SP600125 group*P<0.05 vs control group； #P<0.05 vs LPS group

2.5 心肌組織中JNK蛋白表達

與對照組相比，LPS組JNK蛋白表達增加(P<0.05)；給予SC-211006后，JNK的蛋白表達水平高于LPS組(P<0.05)；給予SC-207394和SP600125后，JNK的蛋白表達量均低于LPS組(P<0.05)；LPS+SC-207394+ SP600125組JNK的蛋白表達量降到最低，明顯低于LPS組(P<0.05，圖3)。

Fig. 3 The expression of JNK protein analyzed by Western blotA: control group; B: LPS group；C: LPS +SC-211006 group; D: LPS+SC-207394 group; E: LPS + SP600125 group; F: LPS+SC-207394+SP600125 group*P<0.05 vs control group； #P<0.05 vs LPS group

3 討論

內(nèi)毒素可通過刺激內(nèi)源性介質(zhì)的釋放來參與新生兒敗血癥的發(fā)生與發(fā)展；也可對新生兒缺氧缺血性腦病引起的腦損傷起增敏作用[3]，探討內(nèi)毒素血癥的診斷和治療一直是新生兒醫(yī)學(xué)的研究重點。盡管抗生素的應(yīng)用可以有效的控制革蘭氏陰性菌的感染，但在殺死革蘭氏陰性菌的同時也導(dǎo)致內(nèi)毒素的大量釋放，使血液中內(nèi)毒素的水平進一步升高，進一步加重內(nèi)毒素血癥。其中內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌損傷是重要的死亡原因之一，也是感染或敗血癥休克難治的原因之一。然而內(nèi)毒素是通過何種方式來誘導(dǎo)心肌損傷，機制尚未完全闡明。

自2003年Wang Rui等[4]首次在大鼠心肌中發(fā)現(xiàn)CaSR后，有關(guān)CaSR在心血管方面的研究取得了長足的進步。徐長慶等認為鈣敏感受體的表達與缺血再灌注心肌細胞損傷的程度呈正相關(guān)，并先后證實了CaSR可能通過MAPK信號通路及Fas受體死亡通路導(dǎo)致心肌細胞凋亡[5]。白淑芝等研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠心肌中CaSR的表達降低，引發(fā)細胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)紊亂，從而導(dǎo)致心臟的收縮和舒張功能異常[6]。最新的研究發(fā)現(xiàn)CaSR可通過促進細胞凋亡來參與心肌梗死的發(fā)展[7]。雖然有關(guān)CaSR與心肌損傷方面的研究頗多，但CaSR在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌損傷中的作用還知之甚少。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號通路是近年來的研究熱點，目前將MAPK分為四個亞族：細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular-signal regulated protein kinase，ERK1/2)、p38 MAPK、JNK、ERK5。其中ERK1/2和ERK5多表現(xiàn)為促進細胞增殖分化和發(fā)育的作用，而JNK及p38MAPK多表現(xiàn)為促進組織炎癥和細胞凋亡的作用[8]。有研究表明，當(dāng)CaSR被激活時，可使MAPK信號通路中的JNK/p38因子激活，調(diào)節(jié)MAPK級聯(lián)，導(dǎo)致細胞損傷[9]。如在慢性癲癇過程中，CaSR表達增加通過激活ERK通路來保護心肌，同時通過激活JNK途徑來促進心肌細胞凋亡[10]。

炎癥是內(nèi)毒素心肌損傷后一個重要的病理環(huán)節(jié)，IL-6是活性較強的炎癥啟動因子，可以參與機體的免疫反應(yīng)過程，常作為早期診斷細菌感染和敗血癥的靈敏指標(biāo)[11]。當(dāng)內(nèi)毒素血癥發(fā)生時，LPS/LBP/CD14三元復(fù)合物可與心臟及血管細胞膜上的TLR4結(jié)合,將信號傳遞到胞內(nèi),進而激活MyD88 依賴的信號通路，隨后通過激活MAPK通路等來啟動LPS炎癥信號通路，導(dǎo)致IL-6、TNF-α等多種炎癥介質(zhì)的釋放[12]。2013年，Li等證實CaSR激動劑三氯化釓使細胞因子IL-6和TNF-β的表達增加。CaSR調(diào)節(jié)細胞因子分泌的過程涉及多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,其中，CaSR介導(dǎo)的MAPK信號通路對細胞因子的分泌起重要作用。

為研究在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌損傷中，CaSR與JNK途徑之間的關(guān)系，本實驗通過建立內(nèi)毒素新生大鼠心肌損傷模型，從形態(tài)學(xué)角度觀察心肌細胞損傷的程度，通過測定血清中LDH的含量來評價內(nèi)毒素對心肌細胞的毒性及心肌損傷的情況，并通過Real Time PCR測定IL-6的mRNA表達情況，以此來反應(yīng)機體的炎癥損傷程度。實驗觀察到，內(nèi)毒素組及CaSR激動劑組心肌損傷嚴重，LDH含量及IL-6的表達增加，而CaSR抑制劑組和JNK抑制劑組心肌損傷減輕，LDH含量及IL-6的表達下降，JNK抑制劑組尤其明顯。這說明內(nèi)毒素可能引起心肌損傷，而CaSR抑制劑和JNK抑制劑可以減輕這種損傷。同時，實驗觀察到激活CaSR可使JNK的蛋白表達增加，心肌損傷加重；而抑制CaSR可使JNK的蛋白表達下降，心肌損傷減輕；當(dāng)應(yīng)用 JNK抑制劑時，CaSR表達下降，心肌損傷進一步減輕；而同時應(yīng)用CaSR抑制劑和JNK抑制劑時，CaSR及JNK的表達量降至最低，心肌損傷明顯減輕。這表明CaSR可能通過激活JNK途徑來誘導(dǎo)內(nèi)毒素心肌細胞的損傷。

既往有研究提出以CaSR作為治療靶點，這在許多疾病中發(fā)揮了重要的作用[13]，如CaSR激動劑西那卡塞可用于血液透析患者繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進的治療[14]，雷奈酸鍶可促進成骨細胞增殖，治療激素性骨質(zhì)疏松[15]。而本實驗研究表明CaSR可能通過JNK途徑參與內(nèi)毒素所致的心肌損傷，并且觀察到，與抑制CaSR相比，抑制JNK對內(nèi)毒素新生大鼠心肌的保護作用更加明顯。因此JNK途徑有望成為治療內(nèi)毒素引起的心肌損傷的重要靶點，既往已有研究表明，硫化氫及烏司他丁可以通過抑制JNK通路的活性來緩解心肌缺血再灌注損傷[16，17]，黃芪多糖可以通過抑制JNK途徑來減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡[18]。然而由于新生兒的心肌尚不成熟，與成人有很大不同，以JNK途徑為靶點的藥物尚未在新生兒中應(yīng)用，與之相關(guān)的動物實驗也十分罕見。在新生兒方面，選擇抑制JNK途徑的靶向藥的假設(shè)是否可行，是否有其他途徑參與內(nèi)毒素心肌的損傷，這些途徑又起到怎樣的作用，本實驗的相關(guān)結(jié)論在體內(nèi)其他的組織器官中是否適用，這些都有待進一步研究。

總之，我們的研究結(jié)果表明CaSR可能通過激活JNK途徑來參與內(nèi)毒素所誘導(dǎo)的心肌損傷，具體機制仍需進一步探討。