陳奕帆， 張李君， 劉清華， 李學(xué)文Δ

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)附屬白求恩醫(yī)院心內(nèi)科， 2. 山西醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室， 山西 太原 030001)

糖尿病(diabetes mellitus, DM)作為一個(gè)世界性的慢性疾病已經(jīng)成為社會(huì)健康的最大危害之一，其高發(fā)病率和死亡率主要由于心血管并發(fā)癥引起。據(jù)估計(jì)，到2040年全球?qū)⒂谐^(guò)693百萬(wàn)的糖尿病患者[1]。糖尿病引起的心臟損傷，常常表現(xiàn)為心臟功能受損、糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)以及終末期的心衰。二肽基肽酶-4(dipeptidylpeptidse 4, DPP-4)抑制劑是一種新型降糖藥，可以提高循環(huán)胰高血糖素樣肽-1(glucagon-likepeptide1, GLP-1)的水平。西格列汀(Sitagliptin)是一種具有心臟保護(hù)作用的選擇性DPP-4抑制劑，研究表明它對(duì)急性冠脈綜合征和心肌梗死大鼠具有保護(hù)作用[2]，也可以通過(guò)AMPK/AKT/GSK-3β通路緩解糖尿病心肌病中的心肌凋亡[3]。本實(shí)驗(yàn)用西格列汀干預(yù)鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠，旨在探討西格列汀對(duì)糖尿病小鼠心肌重構(gòu)和自噬的影響以及AMPK通路發(fā)揮作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

鏈脲佐菌素(STZ)試劑、免疫組化試劑盒購(gòu)致中國(guó)北京索萊寶公司；西格列汀、CompoundC試劑購(gòu)致美國(guó)Med Chem Express公司；縫隙連接蛋白43(Connexin43, Cx43)、自噬微管相關(guān)蛋白LC3B抗體購(gòu)致美國(guó)Cell Signaling Technology；AMPK、內(nèi)參GAPDH抗體購(gòu)致上海生工公司；BNP、TGF-β抗體購(gòu)致中國(guó)萬(wàn)類(lèi)生物公司；辣根過(guò)氧化酶山羊抗兔IgG、預(yù)染Marker、BSA、蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)致武漢博士德公司。

1.2 建立糖尿病小鼠模型和處理

健康10周齡的雄性C57小鼠34只(購(gòu)致山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重約20 g)，飼養(yǎng)條件為20-26℃、12 h晝夜規(guī)律、飲水進(jìn)食無(wú)限。24只小鼠用STZ 50 mg/(kg·d)(溶于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)連續(xù)腹腔注射5 d，7 d測(cè)得小鼠空腹血糖值>16.7 mmol/L視為造模成功。10只正常組小鼠注射等體積生理鹽水緩沖液。把造模成功小鼠再隨機(jī)分為3組，8只作為模型組不再給與任何處理，4周后，剩下16只小鼠隨機(jī)分為兩組均給與口服西格列汀10 mg/(kg·d)，其中一組作為抑制劑組同時(shí)再腹腔注射Compound C 10 mg/(kg·d)(生理鹽水溶解)，給藥6周。

1.3 小鼠心臟取材

給藥6周末，用3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，稱重，快速分離小鼠心臟并用生理鹽水灌注，吸干水分后分離心室稱重，計(jì)算心室/體重比值。將心肌組織做好標(biāo)記，部分組織放入液氮中以備提取心臟組織蛋白，部分組織放于事先準(zhǔn)備好的4%多聚甲醛中，準(zhǔn)備包埋固定。

1.4 HE和Masson染色

小鼠心臟組織10%多聚甲醛固定，然后石蠟包埋切片。蘇木素-伊紅(HE)和馬松(Masson)染色，光鏡下觀察心臟組織的細(xì)胞形態(tài)和纖維化程度。

1.5 Western blot檢測(cè)

BCA法測(cè)蛋白濃度。加入5×loading buffer煮沸5 min。SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，Cx43抗體(1∶1 000)、AMPK抗體(1∶ 1 000)、BNP抗體(1∶1 000)、TGF-β抗體(1∶ 1 000)、LC3抗體(1∶1 000)、GAPDH抗體(1∶ 2 000)4℃孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化酶山羊抗兔IgG二抗(1∶6 000)室溫孵育1.5 h后，ECL發(fā)光液曝光。ImageJ軟件分析灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠心室/體重比的變化

與正常組相比，模型組的小鼠體重沒(méi)有明顯改變，心室/體重比值明顯增高。與模型組相比，治療組心室/體重比值改變有所減輕(表1)。

Tab. 1 Changes of ventricular weight, body weight and ratio in each n=8)

2.2 各組小鼠心肌形態(tài)、纖維化程度

小鼠心臟HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察，心肌細(xì)胞胞漿被染成粉紅色，細(xì)胞核為藍(lán)色。結(jié)果顯示Control組心肌細(xì)胞交連成網(wǎng)，胞漿、胞核及組織結(jié)構(gòu)清晰；DM組心肌細(xì)胞面積增大，胞漿尚且均勻，少量細(xì)胞纖維網(wǎng)絡(luò)斷裂，處理組干預(yù)后心肌細(xì)胞面積減小(圖1)。

Fig. 1 HE staining was used to observe the morphological changes of myocardial cells (×40)A: Control; B: DM; C: DM+Sig

小鼠心臟Masson染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察，心肌細(xì)胞被染成紅色，心肌間質(zhì)膠原纖維及血管周?chē)蝗境伤{(lán)色，藍(lán)色面積越多表示心肌纖維化越明顯。結(jié)果顯示Control組心肌細(xì)胞排列整齊，間質(zhì)少量的條索狀膠原纖維；DM組間質(zhì)膠原纖維開(kāi)始增粗、融合，排列不均，治療組干預(yù)后心肌細(xì)胞排列尚有序，膠原纖維減少(圖2)。

Fig. 2 Masson staining was used to observe the degree of myocardial fibrosis(×40)A: Control; B: DM; C: DM+Sig

2.3 DM心肌組織BNP、TGF-β蛋白表達(dá)變化

以纖維化指標(biāo)轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子β(TGF-β)和心肌肥厚指標(biāo)腦鈉肽(BNP)與GAPDH內(nèi)參的比值作相比較：與正常組相比，在糖尿病小鼠中TGF-β/GAPDH和BNP/GAPDH明顯上升，西格列汀處理組上述變化減輕(圖3，表2)。

Fig. 3 Comparison of expressions of BNP and TGF-β proteins in each groupA: Control; B: DM; C: DM+Sig; DM: Diabetes; Sig: Sitagliptin; CC: Compound C

Tab. 2 Analysis of BNP/GAPDH and TGF-β/GAPDH expressions in three n=5)

2.4 Compound C對(duì)DM小鼠心肌組織Cx43和自噬相關(guān)蛋白的影響

與正常組相比，模型組AMPK/GAPDH、Cx43/GAPDH的比值明顯下降，自噬指標(biāo)LC3B II/I表達(dá)下降。西格列汀處理后，AMPK/GAPDH、Cx43/GAPDH、LC3B II/I比值上升。與處理組相比，抑制劑組上述變化減輕(圖4，表3)。

Fig. 4 Comparison of expressions of cx43 and autophagy-related proteins in each groupA: Control; B: DM; C: DM+Sig; D: DM+Sig+CCDM: Diabetes; Sig: Sitagliptin; CC: Compound C

Tab. 3 Analysis of Cx43/GAPDH, AMPK/GAPDH and LC3BII/I expressions in each n=5)

3 討論

隨著糖尿病在全球的發(fā)病率越來(lái)越高，糖尿病相關(guān)的心臟并發(fā)癥如糖尿病心肌病(DCM)等誘發(fā)的心衰、心律失常和心肌梗死等多種心臟疾病作為糖尿病患者高致死率原因之一[4]。目前關(guān)于糖尿病患者合并心臟并發(fā)癥的治療已經(jīng)取得很大進(jìn)展，二甲雙胍作為常用的降糖藥，具有心臟保護(hù)作用，但是潛在的乳酸中毒風(fēng)險(xiǎn)可能會(huì)導(dǎo)致心肌損傷加重[5]。因此需要找到更有效的治療方式。GLP-1似乎具有這樣的前景，但它的半衰期短，會(huì)被DPP-4轉(zhuǎn)為非活性形式[6]。西格列汀作為一種新型DPP-4抑制劑，可以抑制循環(huán)中GLP-1的降解。除了能夠降低血糖水平，西格列汀具有心臟保護(hù)作用。臨床觀察，無(wú)論有無(wú)冠脈疾病，經(jīng)過(guò)西格列汀治療后的糖尿病患者與未經(jīng)治療的患者相比心功能更好[7]。此外，DCM的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中伴有明顯心肌凋亡和重構(gòu)[8]。自噬作為維持細(xì)胞器和蛋白質(zhì)合成和降解平衡的一種重要體內(nèi)過(guò)程，它有助于維持正常的心臟功能。自噬的激活或者減少可能會(huì)導(dǎo)致心臟損傷，過(guò)量的自噬會(huì)促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[9]，但是自噬減少將導(dǎo)致?lián)p傷或者衰老的細(xì)胞器和蛋白積累并引發(fā)心肌功能障礙[10]。文獻(xiàn)報(bào)道，西格列汀可以通過(guò)促進(jìn)自噬保護(hù)Zucker糖尿病肥胖小鼠的心臟功能[11]。因此本實(shí)驗(yàn)用STZ建立糖尿病小鼠模型模擬，旨在探討西格列汀對(duì)糖尿病心臟重構(gòu)和自噬的影響極其可能的機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)在C57小鼠中采用5 d腹腔注射STZ建立I型糖尿病模型。模型小鼠表現(xiàn)出典型的多飲，多尿等糖尿病的癥狀，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組較正常組體重沒(méi)有明顯改變，但心室/體重比明顯增加，HE染色顯示部分心肌細(xì)胞增大，小鼠心臟BNP蛋白表達(dá)升高，這表明糖尿病小鼠出現(xiàn)心肌肥厚。Masson染色結(jié)果顯示，心肌間質(zhì)藍(lán)色纖維開(kāi)始增多，纖維化相關(guān)的蛋白TGF-β也出現(xiàn)升高。但給與西格列汀干預(yù)后，上述改變明顯減輕，意味著西格列汀可能具有改善糖尿病心肌肥厚，抑制纖維化的作用。

縫隙連接蛋白43(Cx43)是心室肌表達(dá)最多的縫隙連接蛋白，對(duì)于維持心肌正常的電生理傳導(dǎo)非常重要，其表達(dá)、分布和功能的異常參與心律失常的發(fā)生，在DM動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)明顯的Cx43重構(gòu)異常。此外，AMPK被認(rèn)為是細(xì)胞能量傳感器，它的激活對(duì)糖尿病患者的心肌缺血損傷、心肌肥大和心肌凋亡具有保護(hù)作用[12]，DCM患者中AMPK活性降低[13]。因此AMPK通路已經(jīng)成為糖尿病合并心肌病的一個(gè)重要治療靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，AMPK相關(guān)的自噬通路參與血管緊張素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞Cx43的重構(gòu)[14],而在高糖誘導(dǎo)的新生小鼠心肌細(xì)胞中，AMPK通路同樣參與Cx43的重構(gòu)和自噬的激活[15]。目前研究認(rèn)為糖尿病中自噬活性的下調(diào)參與DCM的發(fā)生發(fā)展[16]，這與本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在糖尿病小鼠心臟中自噬活性受到抑制的結(jié)論一致。

為了探討AMPK通路是否參與西格列汀引起的自噬調(diào)節(jié)和Cx43重構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)在西格列汀處理組的基礎(chǔ)上加入AMPK抑制劑Compound C(CC)，探究LC3B和Cx43蛋白的表達(dá)。LC3作為自噬激活的指標(biāo)，當(dāng)自噬激活時(shí)，胞漿型LC3I會(huì)酶解掉一小段多肽轉(zhuǎn)變成模型LC3II參與自噬體的形成，因此LC3II/I的比值可以評(píng)估自噬水平的高低。但大量實(shí)驗(yàn)研究心肌組織的自噬激活主要檢測(cè)LC3BII/I的比值[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CC可以逆轉(zhuǎn)西格列汀導(dǎo)致的Cx43上調(diào)和自噬激活作用。與處理組相比，CC組Cx43蛋白下降和LC3BII/I比值減少。實(shí)驗(yàn)表明在糖尿病小鼠中，自噬受到抑制，西格列汀可以促進(jìn)自噬的激活，并且AMPK通路在其中起著重要作用。

綜上本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明西格列汀可以改善糖尿病小鼠心臟肥厚和纖維化，并且可以通過(guò)AMPK相關(guān)通路促進(jìn)Cx43蛋白的上調(diào)和激活自噬，但更多的機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。