朱明了， 鄭 珍， 樓恩哲， 趙凱婷， 何施燕， 陳佳玉

(紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 浙江 紹興 312000)

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一。在我國，胃癌的發(fā)病率和死亡率均居于癌癥的第二位[1]。每年，全球有723 000名患者死于胃癌[2]，晚期胃癌患者的5年生存率低[3]。由于缺乏早期胃癌特異性診斷指標，且胃癌早期臨床癥狀不明顯，胃癌患者確診時往往已到了腫瘤進展晚期[1]，而現(xiàn)有治療方案和藥物因其具復(fù)發(fā)率高、副作用大、治療成本高等缺點，無法實現(xiàn)對胃癌患者真正意義上的治療，因此，尋找對胃癌有治療作用、毒副作用低的藥物一直是胃癌防治研究的重點和難點。

大蒜是一種重要的藥食兼用植物，具有抗心血管疾病、抗腫瘤、殺菌等功效[4-6]，價格低廉，無毒副作用。大蒜阿霍烯為大蒜的成份之一，有研究資料已證明它可抑制多種腫瘤如食管癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等細胞的增殖，并可誘導(dǎo)細胞凋亡[7-10]，但該成分對胃癌細胞MGC-803的作用尚未見報道。據(jù)報道，胃癌細胞可通過PI3K-AKT-mTOR、RAS-RAF-MEK-ERK通路發(fā)生凋亡[11,12]，為研究大蒜阿霍烯抗胃癌的分子機制提供了思路。本文擬通過研究大蒜阿霍烯對胃癌細胞MGC-803的增殖、凋亡和周期的影響，證實大蒜阿霍烯對胃癌的治療作用，并揭示其作用的相關(guān)分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

CCK-8染色液(同仁，日本)；FITC/PI apoptosis assays kit(BD，美國)；細胞線粒體膜電位JC-1檢測試劑盒(天晶公司，上海)；RPMI 1640培養(yǎng)液、 0.25% Trypsin、和Fetal Bovine serum(FBS)(Gibco，美國)；TRIzol? Reagent、SuperScript? III First-Strand(Invitrogen，美國)；Hoechst 33342(Solarbio，上海)；乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒、(29∶1)聚丙烯酰胺(Acrylamide)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、四甲基二乙胺(TEMED)、pH 8.8 Tris-HCL溶液、pH 6.8 Tris-HCL溶液、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光顯色液(碧云天，上海)；其他的試劑均為國產(chǎn)分析純。實驗所用細胞來源于上海中科院細胞所；BALB/C小鼠購自浙大實驗動物中心。大蒜阿霍烯購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 細胞增殖實驗

用含10% FBS的RPMI 1640完全細胞培養(yǎng)液在37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)胃癌細胞株MGC-803。待其處于對數(shù)生長階段時，0.25%胰酶消化細胞， 1 000 r/min離心5 min, 回收細胞，用PBS洗滌細胞2次，棄上清，用含有10% FBS的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液重懸細胞，并調(diào)整細胞密度為1×104cells/ml，將其加到96孔培養(yǎng)板中，100 μl/well，于37℃ 5% CO2培養(yǎng)，待細胞貼壁后，于培養(yǎng)液中加入大蒜阿霍烯，使其終濃度分別為0 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、25 μmol/L和125 μmol/L，設(shè)三復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h時，用CCK8染色試劑盒染色后，通過酶標儀(490 nm)檢測細胞增殖活性。

1.3 JC-1染色法分析細胞膜電位

取上述細胞密度為1×104cells/ml的MGC-803，置于96孔板中，100 μl/well，設(shè)兩復(fù)孔，5% CO237℃條件下培養(yǎng)至細胞融合度達到80%。棄上清，分別加入含有0 μmol/L、25 μmol/L大蒜阿霍烯的細胞完全培養(yǎng)液100 μl, 37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。棄上清，用PBS洗滌細胞2次，每孔加入50 μl細胞生長培養(yǎng)液和50 μl JC-1染色工作液，混勻。37℃ 5% CO2條件下孵育20 min。用冰上預(yù)冷的JC-1染色緩沖液洗滌細胞2次，每孔加入100 μl細胞培養(yǎng)液，置于熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.4 Hoechst染色觀察細胞核型

取融合度為80%的MGC-803細胞六孔板，加入含有0 μmol/L、25 μmol/L、125 μmol/L大蒜阿霍烯的細胞完全培養(yǎng)液2 ml，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄上清，PBS洗滌細胞3次。每孔加入1 ml 10 ng/ml Hoechst 33342，37℃避光孵育10 min，棄上清，PBS洗滌細胞3次，置于熒光倒置顯微鏡下觀察細胞核型的變化。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期

取融合度為80%的MGC-803細胞，分別加入含有0 μmol/L、25 μmol/L、125 μmol/L大蒜阿霍烯的細胞完全培養(yǎng)液，37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。胰酶消化細胞后用4℃預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次，每次于4℃條件下300 g離心5 min，回收細胞。取1×105的細胞，F(xiàn)ITC和PI雙染并洗滌后，1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，具體操作見試劑說明書。取1×105的細胞，冰浴預(yù)冷的70%乙醇4℃條件固定2 h，4℃ 1 000 r/min離心5 min，棄上清。用預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次，棄上清。加入100 μl 含有RNase A 的PI染液，避光孵育20 min。經(jīng)流式細胞儀檢測，分析細胞周期變化。

1.6 LDH釋放法分析細胞毒性

將1×104cells/ml的MGC-803細胞接種6孔板，2 ml/well，37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)至細胞融合度達到80%，加入大蒜阿霍烯，使其最終濃度為 0 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、25 μmol/L、125 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，設(shè)3復(fù)孔。按照LDH檢測試劑盒說明書進行樣本檢測。

1.7 RT-qPCR分析基因轉(zhuǎn)錄水平的改變

用含有0 μmol/L和25 μmol/L大蒜阿霍烯作用于80%融合度的MGC-803細胞24 h，按照Trizol試劑說明書提取細胞總RNA，經(jīng)Nanodrop定量。取5 μg總RNA，用SuperScript? III First-Strand Synthesis System 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在12.5 μl Power SYBR? Green PCR Master Mix(2×)反應(yīng)體系中檢測、上下游引物各2 μl(10 μmol/L)、模版1 μl，加ddH2O補至25 μl，混勻。置于熒光定量PCR儀中進行擴增，PCR反應(yīng)參數(shù)為95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△CT法分析大蒜阿霍烯作用后基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。

1.8 Western blot檢測細胞內(nèi)蛋白表達

用0 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、25 μmol/L、125 μmol/L的大蒜阿霍烯分別作用于80%融合的MGC-803細胞24 h，收集細胞，加入含有1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液500 μl，作用5 s，4℃ 12 000 r/min離心5 min。取上清，BCA法進行蛋白定量。取20 μg蛋白樣本進行Western blot，Image Quant LAS 4 000 mini超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀分析細胞內(nèi)蛋白表達水平的變化。

1.9 小鼠抑瘤實驗

取PBS洗滌3次后的處于對數(shù)生長期的MGC-803細胞，調(diào)整其細胞濃度為2×107cells/L，腹股溝皮下接種100只4周齡雄性BALB/C鼠，0.1 ml/只。接種兩天后，將動物分組，每組20只，分別經(jīng)皮下注射濃度為0 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、25 μmol/L、125 μmol/L的大蒜阿霍烯，0.1 ml/次，隔天注射一次，并于首次注射腫瘤細胞的第20日每組殺10只，取瘤組織，稱重。記錄剩余小鼠的存活期。

2 結(jié)果

2.1 大蒜阿霍烯對細胞增殖活性的影響

濃度為0 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、25 μmol/L、125 μmol/L的大蒜阿霍烯作用于MGC-803細胞0 h、24 h、48 h、72 h，MTS法檢測細胞的增殖活性。結(jié)果如圖1，大蒜阿霍烯能顯著抑制胃癌MGC-803細胞增殖活性(P<0.01)，其作用效果與藥物作用時間和濃度相關(guān)。

Fig. 1 Theeffects of Z Ajoene on proliferation activity of MGC-803 cells(n=3)

2.2 大蒜阿霍烯對MGC-803細胞線粒體膜電位的影響

胃癌細胞MGC-803經(jīng)25 μmol/L的大蒜阿霍烯作用24 h，JC-1染色，結(jié)果如圖2，MGC-803細胞線粒體膜電位下降。

Fig. 2 The effects of Z Ajoene on cell mitochondrial membrane potential of MGC-803 cells by JC-1 staining(×10)(n=3)

2.3 大蒜阿霍烯對細胞核型的影響

不同濃度大蒜阿霍烯作用MGC-803細胞24 h，經(jīng)Hoechst 33342染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大量細胞發(fā)生核濃縮、染色質(zhì)凝集，并形成了凋亡小體(圖3)。

Fig. 3 The effects of Z Ajoene on nucleus of MGC-803 cells by 33342 staining(n=3)

2.4 大蒜阿霍烯對細胞凋亡與細胞周期的影響

如圖4A所示，MGC-803細胞經(jīng)25 μmol/L和125 μmol/L大蒜阿霍烯作用24 h后，早期細胞凋亡比例分別為31.4%和44.1%，較未用藥的對照組(0.1%)明顯增加。如圖4B所示，經(jīng)25 μmol/L大蒜阿霍烯處理后，MGC-803細胞處于G2期的細胞所占比例(8.2%)較未用藥處理組(19.05%)明顯降低，且處于sub-G1期的細胞所占比例(11.63%)較未用藥處理組(0.53%)明顯增加。說明大蒜阿霍烯可將MGC-803細胞阻滯于G1期，并能夠促進細胞凋亡。

Fig. 4A The apoptosis results detected by flow cytometry(n=3)

Fig. 4B The cell cycle results detected by flow cytometry(n=3)

2.5 大蒜阿霍烯對細胞培養(yǎng)液內(nèi)LDH活性的影響

如圖5所示，MGC-803細胞經(jīng)不同濃度的大蒜阿霍烯作用24 h后，細胞培養(yǎng)液內(nèi)LDH的活性均較未用藥組明顯升高，且與藥物作用的濃度相關(guān)，差異有顯著意義(P<0.01)，大蒜阿霍烯具有一定細胞毒作用。

Fig. 5 The effects of Z Ajoene on LDH release of MGC-803 cells(n=3)

2.6 大蒜阿霍烯對某些基因表達的影響

MGC-803細胞經(jīng)25 μmol/L大蒜阿霍烯作用24 h后， Western blot和RT-qPCR檢測結(jié)果顯示(圖6A和6B)，基因P53、Caspase-3、BAX的轉(zhuǎn)錄和表達水平均較未用藥組顯著上調(diào)(P<0.01)，而RAS、ERK1、BCL-2、AKT、mTOR和PI3K基因的轉(zhuǎn)錄和表達水平均明顯受抑(P<0.01)，其藥物作用效果與用藥濃度有關(guān)。實驗結(jié)果表明25 μmol/L大蒜阿霍烯可上調(diào)P53、Caspase-3、BAX的轉(zhuǎn)錄和表達水平，而下調(diào)RAS、ERK1、BCL-2、AKT、mTOR和PI3K基因的轉(zhuǎn)錄和表達水平。

Fig. 6A The RT-qPCR results(n=3)

Fig. 6B The Western blot results(n=3)

2.7 大蒜阿霍烯對腫瘤生長及小鼠存活期的影響

荷有MGC-803細胞瘤的BALB/C小鼠經(jīng)0 mg/kg、1 mg/kg、5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg的大蒜阿霍烯給藥20 d，取瘤組織，稱重。結(jié)果見表1，大蒜阿霍烯可抑制胃癌的生長，且抑制效果與大蒜阿霍烯作用濃度有關(guān)。同時大蒜阿霍烯可明顯延長荷瘤小鼠的存活期(P<0.01)，尤其25 mg/kg大蒜阿霍烯給藥組延長更為明顯。

Tab. 1 The tumor suppression test n=10)

3 討論

目前許多研究表明，PI3K/AKT/mTOR、RAS/RAF/MEK/ERK信號通路在胰腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療及轉(zhuǎn)歸中起到重要作用[13-15]。資料證實，當細胞受到外界某些藥物刺激時，位于細胞膜上的酪氨酸蛋白激酶受體可被激活，并可通過PI3K的激活，使3，4-二磷酸脂酰肌醇(PIP2)轉(zhuǎn)化為3，4，5-三磷酸脂酰肌醇(PIP3)，PIP3作為第二信使，將信號傳遞到細胞內(nèi)。AKT為PIP3的下游關(guān)鍵蛋白，可以調(diào)控多個與細胞凋亡有關(guān)的家族，在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用?；罨腁KT (p-AKT)可使其下游蛋白mTOR磷酸化，p-mTOR可以通過影響pS6K等核轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化而促進細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成及細胞生長，并通過使細胞周期抑制劑失活調(diào)節(jié)細胞增殖[16]。p-AKT也可以促進MDM2蛋白的磷酸化而使P53發(fā)生降解，從而促進細胞的增殖[17]。P53可直接或間接地促進BAX活化[18]，活化后的BAX可促進線粒體CytC的釋放[19]，進而引起Caspase-3活化，對細胞凋亡發(fā)揮樞紐作用[20]。而BCL-2的作用則相反，它可通過穩(wěn)定線粒體內(nèi)外膜或與凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)結(jié)合，使線粒體外膜透化(MOMP)引起細胞色素C向胞質(zhì)釋放，結(jié)合并激活胞質(zhì)內(nèi)的銜接蛋白Apaf-1，促發(fā)細胞凋亡，而引起細胞死亡[19]。同時，激活的酪氨酸蛋白激酶受體，將使RAS激酶磷酸化，磷酸化的RAS(p-RAS)可以激活RAS/RAF/MEK/ERK信號通路，從而促進細胞的增殖[21]。

在本實驗中，經(jīng)不同濃度大蒜阿霍烯作用后的MGC-803細胞，其細胞增殖活性和線粒體膜電位均顯著下降，細胞凋亡率明顯增加。細胞周期檢測結(jié)果亦證實，25μM的大蒜阿霍烯可以將MGC-803細胞阻滯在G2期之前，從而抑制MGC-803細胞的增殖。Western blot和RT-qPCR結(jié)果證實P53、Caspase-3、RAS、ERK、BCL-2、AKT、mTOR、PI3K基因的轉(zhuǎn)錄、表達水平均較未用藥組明顯降低，而P53、Caspase-3、BAX等基因的轉(zhuǎn)錄、表達水平均明顯升高。上述蛋白為PI3K/AKT/mTOR和RAS/RAF/MEK/ERK信號通路中的重要蛋白，因此大蒜阿霍烯可能是通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR和RAS/RAF/MEK/ERK信號通路蛋白的表達而抑制MGC-803細胞的增殖，誘導(dǎo)細胞的凋亡。體內(nèi)實驗亦證實，大蒜阿霍烯可抑制胃癌生長，并可延長荷瘤小鼠生存期。

綜上所述，大蒜阿霍烯可通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR、RAS/RAF/MEK/ERK信號通路而抑制胃癌細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡。為大蒜阿霍烯抗胃癌的進一步研究打下了基礎(chǔ)。