任吉蓮, 崔靈芝, 郝小夏, 李曉顏, 常彥祥

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系， 汾陽 032200； 2. 山西省腫瘤醫(yī)院干部診療科， 太原 030013； 3. 山西省汾陽醫(yī)院檢驗(yàn)科，汾陽 032200； 4. 西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院， 陜西 西安 710077)

肺癌是最常見的惡性腫瘤，造成全球最多的腫瘤相關(guān)死亡人數(shù)，其中非小細(xì)胞肺癌(nonsmall-cell lung carcinoma，NSCLC)在肺癌中占比最大[1]。當(dāng)前較為有效的療法包括新一代化療藥如多西他賽[2]，以及表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)，如吉非替尼(Gefitinib)等[3, 4]，均展示了明顯的非小細(xì)胞肺癌患者的治療效果。雖然TKIs的治療已經(jīng)取得了顯著的效果，但腫瘤最終復(fù)發(fā)的原因是由于EGFR突變而出現(xiàn)了對(duì)TKIs的獲得性耐藥[5]。除了EGFR突變外，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)單用EGFR-TKI很容易導(dǎo)致包括NSCLC在內(nèi)的腫瘤干細(xì)胞增多[6]。因此，針對(duì)NSCLC的腫瘤干細(xì)胞樣特性制定用于EGFR-TKI輔助治的、可以克服耐藥性的策略，對(duì)于改善預(yù)后和提高未來生存具有重要意義[7]。

厚樸是傳統(tǒng)中藥，常用于治療腸胃紊亂、焦慮、咳嗽、急性疼痛和過敏性疾病。厚樸酚(Magnolol)是從厚樸樹的根和莖的樹皮中分離得到的羥基聯(lián)苯。厚樸酚具有包括抗腫瘤等的廣泛的生物活性。厚樸酚具有良好的安全性，可以減少腫瘤生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。然而，鮮有報(bào)道厚樸酚對(duì)腫瘤干細(xì)胞樣特性的影響。本研究重點(diǎn)關(guān)注厚樸酚對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞干細(xì)胞樣特性的影響及其與吉非替尼的交互影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞購自武漢Procell公司；厚樸酚(M3445)和吉非替尼(SML1657)購自Sigma；CCK-8試劑盒、10% SDS-PAGE、PVDF膜、羊抗兔IgG-HRP、ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、Giemsa染色液、胰蛋白酶、碘化丙啶、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自北京Solarbio公司；Western Blot抗體增殖標(biāo)記蛋白Ki67(1∶1 000)、增殖和核原蛋白(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)(1∶1 000)、B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma 2, Bcl-2) (1∶1 000)、Bcl-2相關(guān)X調(diào)往調(diào)節(jié)蛋白(Bcl-2 associated X apoptosis regulator, Bax)(1∶1 000)、性別決定區(qū)Y- 盒2(Sex determining region Y-box 2, SOX2)(1∶1 000)、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4 (Octamer-binding transcription factor 4 OCT4)(1∶1 000)、actin(1∶1 000)購自美國CST公司；10 mg/mL RnaseA購自上海翊圣生物科技有限公司；流式抗體CD44、CD133購自英國Abcam公司。Multiskan FC酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher公司；FACSAria II流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理

除了克隆形成實(shí)驗(yàn)，處理時(shí)間為24 h。對(duì)于CCK-8實(shí)驗(yàn)，配制500 μmol/L厚樸酚，分別取100 μl、80 μl、60 μl、40 μl、20 μl、10 μl、5 μl及1.25 μl(取四倍體積于單個(gè)邊緣孔，加入培養(yǎng)基至400 μl)，分配于每個(gè)濃度的4個(gè)復(fù)孔。配制100 μmol/L吉非替尼，二倍稀釋法稀釋直至0.625 μmol/L組(每個(gè)濃度4個(gè)復(fù)孔)。CCK-8以加入1 μl PBS的培養(yǎng)基為對(duì)照。對(duì)于其他實(shí)驗(yàn)，采用對(duì)照組、厚樸酚組、吉非替尼組和厚樸酚+吉非替尼組的析因分析設(shè)計(jì)。對(duì)照組加正常培養(yǎng)基，厚樸酚濃度為100 μmol/L、吉非替尼濃度5 μmol/L，共處理組同時(shí)加入兩藥。

1.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)

根據(jù)制造商的操作說明，使用CCK-8試劑盒檢測(cè)A549細(xì)胞的活力。將細(xì)胞接種至96孔板，厚樸酚及吉非替尼分別處理上述細(xì)胞，在37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。將10 μl CCK-8溶液添加至上述孔中，再培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)每個(gè)孔在450 nm處的吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)

將A549細(xì)胞接種于6孔板中，每孔200個(gè)細(xì)胞，加藥后連續(xù)培養(yǎng)7 d。廢棄培養(yǎng)基，每個(gè)孔用PBS仔細(xì)洗兩次。將菌落在甲醇中固定20 min，然后用Giemsa染色液染色。統(tǒng)計(jì)≥50個(gè)細(xì)胞的菌落數(shù)，計(jì)算菌落形成效率(菌落百分比=菌落形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%)。

1.5 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)

用10% SDS-PAGE分離細(xì)胞和腫瘤中的蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在被5%脫脂牛奶封閉后，蛋白質(zhì)與第一抗體在4℃下孵育過夜。主要抗體如下：Ki67(1∶1 000)、PCNA(1∶1 000)、Bax(1∶ 1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、SOX(1∶1 000)、OCT4(1∶1 000)、actin(1∶1 000)。PBS洗滌，羊抗兔IgG-HRP孵育1 h。用ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒觀察這些條帶。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)

用胰蛋白酶消化A549細(xì)胞，用70%乙醇在4℃下過夜固定細(xì)胞。然后加入10 mg/ml RnaseA和碘化丙啶于4℃染色過夜。使用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)按照說明書使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。AnnexinV-FITC(-) / PI(-)(左下)為正常細(xì)胞，AnnexinV-FITC (+) / PI(-)細(xì)胞(右下)為早期凋亡細(xì)胞，AnnexinV-FITC (+) / PI(+)(右上)為晚期凋亡細(xì)胞。AnnexinV(-)/ PI(+)(左上)為壞死細(xì)胞。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

將1×106個(gè)細(xì)胞加入在PBS中，添加100 μl 1% 胎牛血清、1 μg CD16/CD32，放置冰上孵育30 min用于阻斷非特異性Fc相互作用，然后用PE-CD133, FITC-CD44和eFluor 660- ESA 抗體標(biāo)記1 h。標(biāo)記后的細(xì)胞在1%胎牛血清的PBS中重懸，用流式細(xì)胞儀分析。同型IgG和未染色細(xì)胞作為陰性對(duì)照。使用相同的設(shè)置，利用流式細(xì)胞儀對(duì)CD44和CD133標(biāo)記的A549細(xì)胞進(jìn)行分選，獲得CD133+CD44-和CD133-CD44+亞群。PI(1 μg/ml)添加到細(xì)胞懸液排除分選中的死細(xì)胞。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 厚樸酚和吉非替尼對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞活力的影響

CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力。如圖1A所示，厚樸酚100 μmol/L以下對(duì)細(xì)胞活力無顯著影響，而100 μmol/L以上濃度的厚樸酚組細(xì)胞活力現(xiàn)在降低(P<0.05)。如圖1B所示，5 μmol/L以下濃度的吉非替尼組細(xì)胞活力無顯著變化，而10 μmol/L以上吉非替尼組細(xì)胞活力現(xiàn)在降低(P<0.05)。因此，選取100 μmol/L厚樸酚和5 μmol/L吉非替尼進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Fig. 1 Effects of magnolol and gefitinib on the viability of A549 cells (n=3)A: The viability of A549 cells treated with magnolol; B: The viability of A549 cells treated with gefitinib*P<0.05 vs control group

2.2 厚樸酚和吉非替尼對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖的影響

克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)增殖情況。如圖2A所示，與對(duì)照組比較，厚樸酚組與吉非替尼組的克隆形成率顯著降低(P<0.05)；與吉非替尼組比較，厚樸酚+吉非替尼組的克隆形成率顯著降低(P<0.05)。Western Blot檢測(cè)增殖相關(guān)蛋白表達(dá)。如圖2B所示，與對(duì)照組比較，厚樸酚組與吉非替尼組的Ki67和PCNA蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)；與吉非替尼組比較，厚樸酚+吉非替尼組的Ki67和PCNA蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。上述實(shí)驗(yàn)表明，厚樸酚可協(xié)同吉非替尼抑制A549細(xì)胞增殖，且厚樸酚與吉非替尼存在交互作用(P<0.05)。

Fig. 2 Effects ofmagnolol and gefitinib on proliferation of A549 cells in non-small cell lung cancer (n=3)A: The cloning formation rate was measured by cloning formation assay; B: The expression levels of proliferation-related proteins were detected by Western blot*P<0.05 vs control group

2.3 厚樸酚和吉非替尼對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡情況。如圖3A所示，與對(duì)照組比較，厚樸酚組與吉非替尼組的細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與吉非替尼組比較，厚樸酚+吉非替尼組的克隆形成率顯著升高(P<0.05)。Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。如圖3B所示，與對(duì)照組比較，厚樸酚組與吉非替尼組的Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比例顯著上調(diào)(P<0.05)；與吉非替尼組比較，厚樸酚+吉非替尼組的Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比例顯著上調(diào)(P<0.05)。厚樸酚可協(xié)同吉非替尼促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡，且厚樸酚與吉非替尼存在交互作用(P<0.05)。

Fig. 3 Effects ofmagnolol and gefitinib on apoptosis of A549 cells in non-small cell lung cancer (n=3)A: The cell apoptosis rate was measured by cytometry; B: The expression levels of apoptosis-related proteins were detected by Western blot*P<0.05 vs control group

2.4 厚樸酚和吉非替尼對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)記蛋白表達(dá)。如圖4A和4B所示，與對(duì)照組比較，厚樸酚組與吉非替尼組的SOX2和OCT4蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)；與吉非替尼組比較，厚樸酚+吉非替尼組的SOX2和OCT4蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。上述實(shí)驗(yàn)表明，厚樸酚可協(xié)同吉非替尼抑制A549細(xì)胞干細(xì)胞特性，且厚樸酚與吉非替尼存在交互作用(P<0.05)。

Fig. 4 Effects ofmagnolol and gefitinib on stem cell markers of A549 cells in non-small cell lung cancer (n=3)A: The expression levels of stem cell marker proteins were detected by Western blot; B: The statistical graph of Western blot*P<0.05 vs control group

2.5 厚樸酚和吉非替尼對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞干細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)量。如圖5A和5B所示，與對(duì)照組比較，厚樸酚組與吉非替尼組的CD44+和CD133+細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P< 0.05)；與吉非替尼組比較，厚樸酚+吉非替尼組的CD44+和CD133+細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.05)。上述實(shí)驗(yàn)表明，二者協(xié)同抑制干細(xì)胞樣特性，且厚樸酚與吉非替尼存在交互作用(P<0.05)。

3 討論

厚樸酚可抑制肺癌細(xì)胞增殖，降低腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株經(jīng)厚樸酚處理后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，它還有助于AIF的核轉(zhuǎn)位、內(nèi)切酶G的激活和PARP的裂解[9]。體外對(duì)A549和H1299細(xì)胞的研究表明，厚樸酚在G0/G1期引起細(xì)胞周期阻滯，同時(shí)上調(diào)促凋亡蛋白的表達(dá)。此外，A549異種移植瘤模型體內(nèi)，通過表觀遺傳激活DR5，進(jìn)而激活死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。對(duì)A549體外研究證實(shí)，厚樸酚通過抑制微管聚合導(dǎo)致細(xì)胞周期在有絲分裂期停止，而厚樸酚對(duì)A549腫瘤異種移植模型的研究中，腫瘤生長抑制[11]。本研究的結(jié)果與之前的報(bào)道一致，厚樸酚抑制了A549細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，而且，厚樸酚抑制SOX2和OCT4蛋白，減少了CD44+和CD133+細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)而抑制了A549干細(xì)胞特性。

對(duì)細(xì)胞干性的調(diào)控可能是厚樸酚的潛在功能。如厚樸酚通過線粒體誘導(dǎo)活性氧和凋亡、激活mTOR相關(guān)自噬從而抑制小鼠胚胎干細(xì)胞的胚狀體分化[12]。我們發(fā)現(xiàn)，厚樸酚能一定程度的減少感性標(biāo)志物表達(dá)，降低感性標(biāo)志物表達(dá)的細(xì)胞占比，與吉非替尼共用能更為顯著的抑制A549 的干性，且吉非替尼和厚樸酚具有交互作用。我們的研究支持厚樸酚或許能用來對(duì)抗吉非替尼治療中腫瘤干細(xì)胞增加的對(duì)策性輔助療法。

天然化合物可從細(xì)胞毒性、免疫增強(qiáng)和輔助治療等方面發(fā)揮抗癌作用。如芹菜多糖增強(qiáng)荷瘤小鼠對(duì)肺癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)[13]；葛根素可以直接誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡[14]；又如丹參酮IIA通過調(diào)控VEGFR/Akt通路逆轉(zhuǎn)人非小細(xì)胞肺癌中的吉非替尼耐藥[15]。類似地，本研究發(fā)現(xiàn)，厚樸酚強(qiáng)化了吉非替尼對(duì)A549細(xì)胞的抗增殖、促凋亡及減弱干細(xì)胞樣特性的作用，表明厚樸酚增強(qiáng)了A549細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感。

綜上所述，厚樸酚可與吉非替尼協(xié)同作用，抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。具體機(jī)制可能是通過抑制A549的干細(xì)胞樣特性。