李洪霞， 劉 芳， 夏俊華

(臨沂市胸科醫(yī)院， 山東 臨沂 276034)

我國是肺癌高發(fā)國家之一，肺癌患者年死亡人數(shù)已超過60萬，更有專家預(yù)測到2025年肺癌年死亡人數(shù)將高達100萬[1]。由于起病隱匿，肺癌確診時多為中晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移，失去最佳治療時機，大大縮短了患者的生存期。因此，了解肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的分子機制，尋求早期診斷標志物或治療靶點對改善肺癌患者治療現(xiàn)況意義重大。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是短鏈非編碼RNA，其在機體生長、發(fā)育和維持機體穩(wěn)態(tài)的各種基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用，與人類疾病密切相關(guān)，尤其是癌癥[2]。大量研究表明miR-186[3]、miR-149[4]、miR-367[5]等多種miRNA作為癌基因或抑癌基因調(diào)控下游基因或蛋白表達參與肺癌肺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移。miR-670-5p是miRNAs成員之一，近期研究顯示肝癌組織、細胞中miR-670-5p表達上調(diào)，miR-670-5p高表達促進肝癌細胞增殖[6]。但目前尚未有miR-670-5p在肺癌中潛在作用的相關(guān)研究。因此，本研究通過檢測肺癌組織中miR-670-5p的表達水平，觀察抑制miR-670-5p對肺癌細胞增殖、遷移侵襲的影響，初步探索其可能的分子機制，以期為miR-670-5p在肺癌臨床診療中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 組織樣本

收集2016年1月至2017年10月于我院進行肺癌切除患者的腫瘤組織和癌旁組織28例，病理類型均為非小細胞肺癌。取出的腫瘤組織和癌旁正常組織立即經(jīng)液氮冷凍并于-80℃冰箱保存。所有患者術(shù)前均未接受其他治療。其中男性22例，女性6例；年齡50～72歲，中位年齡61歲。本研究在開展前經(jīng)本院倫理委員會批準。

1.2 細胞和試劑

人肺癌細胞株A549購于美國ATCC；RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清、青鏈霉素雙抗購于美國Gibco公司；模擬物陰性對照(miR-NC)、miR-670-5p模擬物(miR-670-5p mimics)、抑制物陰性對照(anti-miR-NC)、miR-670-5p抑制物(anti-miR-670-5p)、小干擾RNA陰性對照(si-NC)、WWOX小干擾RNA(si-WWOX)購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；野生型熒光素酶報告載體(WT-WWOX)、突變型熒光素酶報告載體(MUT-WWOX)購于Promega公司；Trizol試劑、細胞計數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit 8，CCK-8)、二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell小室和基質(zhì)膠購于美國BD公司；鼠源P21抗體、鼠源上皮細胞鈣粘蛋白(E-cadherin)抗體購于美國CST公司；兔源基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)抗體、兔源磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購于美國Abcam公司；山羊抗鼠抗體、山羊抗兔抗體購于廣州銳博生物。

1.3 人肺癌A549細胞的培養(yǎng)

采用DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗)在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對數(shù)期細胞進行后續(xù)實驗。

1.4 實驗分組和處理

將對數(shù)期A549按照2×105cells/well的密度接種6孔板，當細胞生長至50%融合時按照LipofectamineTM2000使用說明進行細胞轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染RNA與opti-MEM培養(yǎng)液混合，孵育5 min；同時將LipofectamineTM2000與opti-MEM培養(yǎng)液混合，孵育5 min。將上述混合物混勻，室溫孵育20 min，然后加至50%融合A549。根據(jù)轉(zhuǎn)染RNA不同分為以下幾組。anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC)、anti-miR-670-5p組(轉(zhuǎn)染anti-miR-670-5p)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-670-5p組(轉(zhuǎn)染miR-670-5p mimics)、anti-miR-670-5p+si-NC組(轉(zhuǎn)染anti-miR-670-5p與si-NC)、anti-miR-670-5p+si-WWOX組(轉(zhuǎn)染anti-miR-670-5p與si-WWOX)。收集轉(zhuǎn)染48 h細胞，實時熒光定量PCR(RT-qPCR)或蛋白質(zhì)印記(Western blot)檢測轉(zhuǎn)染效果，隨后進行下一步實驗。

1.5 RT-qPCR檢測miR-670-5p的表達水平

Trizol試劑分別提取肺癌組織、癌旁組織、按照上述分組進行干預(yù)的各組A549細胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)為cDNA后，按照Takara熒光定量PCR試劑盒說明書進行PCR反應(yīng)，以U6為內(nèi)參，運用2-ΔΔCt分析miR-670-5p的表達水平。每組設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.6 CCK-8法檢測細胞活力

將A549細胞接種于6孔板，按照實驗分組進行細胞轉(zhuǎn)染，分別在轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h時，每孔加10 μl的CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標儀檢測450 nm波長處各孔的吸光度值，繪制細胞活力曲線。每組設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.7 Transwell法檢測細胞遷移和侵襲

將Transwell小室置于24孔板中。侵襲實驗前，取50 μl按照1∶8稀釋的基質(zhì)膠鋪于小室內(nèi)，4℃凝固后備用。遷移實驗無需鋪膠。收集按照細胞分組轉(zhuǎn)染48 h的各組細胞，消化后制成3×105cells/ml的細胞懸液。向小室上室內(nèi)加入200 μl的細胞懸液，下室加入500 μl的含20%血清的培養(yǎng)基，將含有小室的24孔板置于細胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出小室，擦去上室面未過膜細胞，甲醇固定下室面15 min，結(jié)晶紫染色后置于顯微鏡下觀察并拍照，計算穿膜細胞數(shù)。每組設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.8 Western blot檢測P21、E-cadherin、MMP-2蛋白表達

細胞轉(zhuǎn)染48 h時，收集細胞加入RIPA裂解15 min后提取細胞蛋白。BCA試劑盒測定蛋白濃度。取30 μg等量蛋白上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳分析細胞蛋白后，進行常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶室溫封閉膜1 h，加入Ⅰ抗稀釋液4℃孵育過夜。洗膜后，加入Ⅱ抗稀釋液室溫孵育1 h。洗膜后進行化學發(fā)光顯色。以GAPDH為內(nèi)參照，運用Imagel J軟件分析目的蛋白的表達水平。每組設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.9 雙熒光素酶報告實驗

采用targetscan進行靶基因預(yù)測顯示miR-670-5p與WWOX之間可能存在相互作用，于是采用雙熒光素酶報告實驗進行驗證。將miR-670-5p mimics、miR-NC分別與WT-WWOX或者MUT-WWOX共轉(zhuǎn)染至A549細胞，轉(zhuǎn)染48 h檢測細胞熒光素酶活性變化。每組設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.10 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 miR-670-5p在肺癌組織和癌旁組織中的表達

圖1顯示，肺癌組織中miR-670-5p的表達水平較癌旁組織顯著升高(P<0.05)。

Fig. 1 miR-670-5p expressions in lung cancer and adjacent tissues(n=28)*P<0.05 vs the paracancerous tissue group

2.2 抑制miR-670-5p對細胞A549細胞存活率的影響

表1和圖2顯示，與anti-miR-NC組比較，anti-miR-670-5p組A549細胞miR-670-5p的表達水平顯著降低，P21蛋白的表達水平顯著升高，細胞活力(48 h、72 h)顯著降低(P<0.05)。

Tab. 1 Effects of miR-670-5p on cell viability in A549 n=9)

Fig. 2 Effects of miR-670-5p on cell viability and P21 protein expression in A549 cells (n=9)

2.3 抑制miR-670-5p對細胞A549遷移、侵襲的影響

表2和圖3顯示，與anti-miR-NC組比較，anti-miR-670-5p組A549細胞E-cadherin蛋白的表達水平顯著升高，MMP-2蛋白的表達水平顯著降低，遷移和侵襲細胞數(shù)目顯著減少(P<0.05)。

Fig. 3 Effects of miR-670-5p on migration, invasion and protein expression of A549 cells

Tab. 2 Effects of inhibition miR-670-5p on migration and invasion of cells n=9)

2.4 miR-670-5p靶向調(diào)控WWOX表達

采用生物信息學分析工具targetscan進行靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)，WWOX的3’UTR區(qū)域含有miR-670-5p的互補序列，見圖4A。雙熒光素酶報告實驗顯示，與miR-NC和WT-WWOX共轉(zhuǎn)染組比較，miR-670-5p mimics和WT-WWOX共轉(zhuǎn)染組A549細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；與miR-NC和MUT-WWOX共轉(zhuǎn)染組比較，miR-670-5p mimics和MUT-WWOX共轉(zhuǎn)染組A549細胞熒光素酶活性變化無統(tǒng)計學意義，見表3。Western blot檢測顯示，與miR-NC組比較，miR-670-5p組A549細胞WWOX蛋白的表達水平顯著降低(0.09±0.01vs0.32± 0.03，P<0.05)；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-670-5p組A549細胞WWOX蛋白的表達水平顯著升高(0.67±0.06vs0.34±0.03，P<0.05)。以上結(jié)果提示miR-670-5p靶向調(diào)控WWOX表達。

Fig. 4 miR-670-5p targeted regulation WWOX expressionA： 3’UTR of WWOX contained miR-670-5p complementary sequence; B： miR-670-5p regulated WWOX protein expression

Tab. 3 Double luciferase report n=9)

2.5 抑制WWOX能逆轉(zhuǎn)抑制miR-670-5p對A549細胞存活率的影響

表4和圖5顯示，與anti-miR-670-5p+si-NC組比較，anti-miR-670-5p+si-WWOX組A549細胞WWOX蛋白的表達水平顯著降低，P21蛋白的表達水平顯著降低，細胞存活率顯著增加(P<0.05)。

Tab. 4 WWOX inhibition reversed the effects of inhibition miR-670-5p on A549 cell survival n=9)

Fig. 5 Inhibition of WWOX could reverse the effect of miR-670-5p on cell viability and P21 protein expression in A549 cells(n=9)

2.6 抑制WWOX能逆轉(zhuǎn)抑制miR-670-5p對細胞A549遷移、侵襲的影響

表5和圖6顯示，與anti-miR-670-5p+si-NC組比較，anti-miR-670-5p+si-WWOX組A549細胞E-cadherin蛋白的表達水平顯著降低，MMP-2蛋白的表達水平顯著升高，遷移和侵襲細胞數(shù)目顯著增加(P<0.05)。

Fig. 6 Inhibition of WWOX can reverse the effects of miR-670-5p on migration, invasion and protein expression of A549 cells

Tab. 5 WWOX inhibition reversed the effects of inhibition miR-670-5p on migration and invasion of cells n=9)

3 討論

隨著我國工業(yè)現(xiàn)代化的發(fā)展，肺癌發(fā)病率和死亡率快速上升，已成為危害人類健康的公共衛(wèi)生問題。盡管目前肺癌臨床診療水平取得一定進展，但其治療效果并不顯著。因此，找尋與肺癌進展有關(guān)的基因，開發(fā)新的分子靶向治療策略對提高晚期肺癌患者的生存率有重要意義。

miRNAs是一類高度保守的內(nèi)源性非編碼短鏈RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平參與對人類約60%基因表達的調(diào)控。近年來，越來越多的證據(jù)表明，miRNA通過調(diào)控癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等多種生物學過程，發(fā)揮癌基因或抑癌基因的功能[7，8]。miR-670-5p是最近發(fā)現(xiàn)的miRNA，目前關(guān)于miR-670-5p的報道僅有3篇。Shi等[6]對28例肝癌組織和與其對應(yīng)的癌旁組織中miR-670-5p表達情況進行檢測發(fā)現(xiàn)，至少60%的肝癌組織中miR-670-5p的表達較癌旁組織增加了三倍以上，抑制miR-670-5p表達可抑制肝癌細胞的增殖。Nolte E等[9]指出洋地黃毒甙及其類似物對腎細胞癌細胞的生長抑制以及G2/M細胞周期阻滯作用可能與下調(diào)miR-670-5p表達有關(guān)。然而，在食管鱗癌中miR-670-5p下調(diào)卻促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲，這可能與miRNA表達組織特異性有關(guān)[10]。本研究采用RT-qPCR對28例肺癌組織和與其對應(yīng)的癌旁組織中miR-670-5p的表達水平進行檢測發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中miR-670-5p的表達水平顯著升高，提示miR-670-5p在肺癌中可能發(fā)揮癌基因作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染anti-miR-670-5p后A549細胞中miR-670-5p的表達水平降低，提示轉(zhuǎn)染效果較好。功能分析顯示抑制miR-670-5p表達后A549細胞存活率、遷移侵襲能力顯著降低。E-cadherin是維持上皮細胞極性和緊密連接的重要分子，MMP家族蛋白在腫瘤轉(zhuǎn)移中參與對細胞質(zhì)基質(zhì)的破壞，E-cadherin表達減少和MMP表達增加是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要途徑[11-13]。檢測增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達發(fā)現(xiàn)，抗增殖蛋白P21、抗遷移侵襲蛋白E-cadherin的表達顯著增加，促遷移侵襲蛋白MMP-2的表達顯著降低。提示抑制miR-670-5p表達可顯著抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，miR-670-5p是肺癌診療的潛在靶點。

為揭示miR-670-5p肺癌中的作用，采用生物信息學分析工具targetscan預(yù)測miR-670-5p的靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-670-5p可能與WWOX之間存在相互作用。人WWOX基因定位于染色體上常見的脆性位點FRA16D，跨越1百萬個堿基，包含9個外顯子。研究顯示W(wǎng)WOX在乳腺癌[14]、口腔鱗癌[15]等侵襲性腫瘤中經(jīng)常表達下調(diào)，恢復(fù)WWOX表達可抑制腫瘤的生長。在肺癌中WWOX表達水平與肺癌侵襲性呈負相關(guān)，過表達WWOX可抑制高侵襲性肺癌細胞的活力和侵襲能力，抑制MMP-9表達，促進細胞凋亡[16]。此外，抑制miR-24通過靶向WWOX可抑制非小細胞肺癌細胞的惡性進展[17]。本研究顯示miR-670-5p可直接與WWOX結(jié)合并抑制WWOX表達。于是推測miR-670-5p可能通過靶向WWOX參與肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。進一步研究顯示干擾WWOX表達可逆轉(zhuǎn)抑制miR-670-5p對A549增殖、遷移侵襲、以及P21、E-cadherin和MMP-2表達的影響。提示抑制miR-670-5p通過靶向WWOX抑制肺癌細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，miR-670-5p在肺癌組織中表達上調(diào)，miR-670-5p通過靶向WWOX可促進肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。miR-670-5p有望成為肺癌診療的分子靶點。