賀英昊， 方 情， 楊玲玲， 陳思敏， 駱燕萍， 錢 虹， 齊敏友

(浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院藥理研究所， 杭州 310014)

酮康唑(Ketoconazole，KCZ)是一種咪唑類廣譜抗真菌藥，臨床主要用于皮膚、胃腸道真菌感染，以及婦科疾病如陰道白色念珠菌病等深、淺部真菌病的治療，但其同時(shí)會(huì)對(duì)機(jī)體帶來(lái)嚴(yán)重的不良反應(yīng)[1-3]。目前研究顯示，酮康唑可導(dǎo)致患者出現(xiàn)胃腸道反應(yīng)、肝功能損傷及性激素分泌紊亂等癥狀[4，5]。Banankhah等研究發(fā)現(xiàn)，酮康唑可使健康志愿者發(fā)生肝損傷，進(jìn)而導(dǎo)致肝血清生化指標(biāo)異常[6]。Franziska 認(rèn)為，酮康唑可以導(dǎo)致巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)的分泌增加，而可以控制細(xì)胞增殖、分化的MIF，被認(rèn)為是肝損傷的一個(gè)重要的早期標(biāo)志物[7]。對(duì)于酮康唑引起的肝損傷機(jī)制，Iwasaki 認(rèn)為，可能與其抑制肝代謝酶的活性有關(guān)[8]。除肝毒性外，酮康唑同樣存在不容忽視的生殖毒性，例如男性生殖功能障礙。先前研究表明，酮康唑會(huì)引起雌二醇/睪酮比值增大，最終導(dǎo)致男性乳房發(fā)育和精液稀少[9]。此外，Ankley等研究發(fā)現(xiàn)，酮康唑可以抑制與生殖發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞色素P450家族 19(cytochrome P450 family 19，CYP 19)酶的表達(dá)，進(jìn)而抑制黑頭軟口鰷魚(pimephales promelas)睪酮的生物合成，反映了酮康唑存在一定的生殖系統(tǒng)毒性[10]。

隨著酮康唑的應(yīng)用逐漸增多，其肝毒性的發(fā)生變得十分常見，總發(fā)病率可達(dá) 3.6% 至4.2%，并且不按說(shuō)明書服用藥物更會(huì)增加肝損傷的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[11]。此外，酮康唑同樣會(huì)影響男性生殖系統(tǒng)的功能，例如其導(dǎo)致的血漿睪酮水平降低[12]。本實(shí)驗(yàn)觀察不同劑量酮康唑?qū)π∈蟾闻K、睪丸生理功能的影響，為相關(guān)動(dòng)物模型的建立和臨床安全用藥提供實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

酮康唑(HPLC≥98%，湖南上禾生物科技有限公司)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒、乳酸脫氫酶試劑盒、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶試劑盒、酸性磷酸酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)；4% 多聚甲醛(武漢賽維爾生物科技有限公司)。紫外分光光度計(jì)(鞏義市英峪予華儀器廠)；高速冷凍離心機(jī)(德國(guó) Hermle 公司)；Nikon TS100 光學(xué)倒置相差顯微鏡(尼康上海有限公司)；HM 325 型 MICROM 輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(德國(guó)美康公司)；-80℃ 超低溫冰箱(美國(guó)Thermo公司)；超純水儀(英國(guó) ELIGA 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康雄性昆明小鼠 40 只，SPF 級(jí)，18～22 g，由浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證號(hào)：SCXK(浙)-2008-0033。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)將 40 只小鼠分為 4 組，每組 10 只：正常組、酮康唑低劑量組(30 mg/kg)、酮康唑中劑量組(50 mg/kg)、酮康唑高劑量組(70 mg/kg)。藥物組小鼠按0.1 ml/10 g給藥體積每日單次皮下注射相應(yīng)劑量酮康唑，酮康唑低、中、高劑量組藥物濃度各為3 mg/ml、5 mg/ml、7 mg/ml，正常組給予等量生理鹽水，連續(xù) 3 周。

1.3 樣本收集

末次給藥 24 h 后，摘取小鼠眼球取血并收集血液，常溫靜置后 4℃ 離心取上清液，保存于 -20℃ 冰箱備用。肝臟與睪丸組織的獲取：小鼠處死后，迅速開腹，小心摘取肝臟與睪丸，并于 0.9% 生理鹽水漂洗后，去除表面水分，部分組織置于 4% 多聚甲醛溶液固定，剩余組織快速置于 -80℃ 冰箱保存待用。

1.4 生化指標(biāo)檢測(cè)

依據(jù)試劑盒說(shuō)明書測(cè)定血清 ALT 與 AST 活性；冰上勻漿睪丸組織并離心，提取上清液后根據(jù)試劑盒說(shuō)明書測(cè)定 LDH、γ-GT 與 ACP 的活性。

1.5 病理學(xué)檢測(cè)

將肝臟與睪丸組織置于 4% 多聚甲醛溶液固定 72 h 后，石蠟包埋肝臟與睪丸組織，并切成 4 μm 厚的切片，65℃ 烘烤 40～60 min，二甲苯浸泡 15 min，梯度水洗后，用蘇木精和伊紅染液染色并梯度脫水、二甲苯透明后封片，最后在光學(xué)倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 酮康唑?qū)π∈笱?ALT、AST 活性的影響

與正常組小鼠比較，各藥物組小鼠 ALT、AST 活性均顯著升高(P<0.01)，且其活性的升高均隨給藥劑量的增加而增加，以酮康唑高劑量組活性增高最為顯著；與酮康唑低劑量組相比，中劑量組小鼠ALT、AST 活性顯著升高(P<0.01)；與酮康唑中劑量組相比，高劑量組小鼠ALT、AST 活性顯著升高(P<0.01，表 1)。上述結(jié)果提示，酮康唑可誘導(dǎo)小鼠肝損傷。

Tab. 1 Changes in serum levels of ALT and AST of mice in each group n=10)

2.2 酮康唑?qū)π∈蟛G丸組織 γ-GT、ACP、LDH 活性的影響

與正常組小鼠相比，各藥物組小鼠 γ-GT、ACP、LDH 的活性顯著下降(P<0.01)，且以高劑量組活性下降最為明顯(P<0.01，表 2)；酮康唑 3 個(gè)劑量組之間γ-GT、ACP、LDH活性差異均無(wú)顯著性(P>0.05)。上述結(jié)果表明，酮康唑可誘導(dǎo)小鼠睪丸組織損傷。

Tab. 2 Changes of γ-GT, ACP and LDH in testis tissue of mice in each group(U/g pro, n=10)

2.3 酮康唑?qū)π∈蟾闻K組織形態(tài)學(xué)的影響

由圖 1 可見，正常組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核大而圓，肝索整齊、緊密排列，肝血竇規(guī)則，為正常形態(tài)結(jié)構(gòu)。

藥物組小鼠可見肝組織壞死形態(tài)結(jié)構(gòu)，壞死區(qū)肝細(xì)胞排列混亂且有水樣變性，胞質(zhì)色淡，細(xì)胞膜消失現(xiàn)象明顯，肝索與肝血竇形態(tài)結(jié)構(gòu)模糊。其中，低劑量組部分肝細(xì)胞水腫，細(xì)胞排列較不規(guī)則；中劑量組肝細(xì)胞部分壞死，細(xì)胞核染色加深，肝血竇較不規(guī)則，表現(xiàn)為急性普通型肝炎形態(tài)結(jié)構(gòu)；而高劑量組肝細(xì)胞損傷最大，細(xì)胞間隙增大，肝索排列混亂，肝血竇不規(guī)則，整體肝組織表征為急性重癥肝炎形態(tài)結(jié)構(gòu)。上述結(jié)果表明，酮康唑可誘導(dǎo)小鼠肝毒性。

Fig. 1 Liver histopathology of each group(HE ×400)A： Control group； B： Low-dose group； C： Medium-dose group； D： High-dose group

2.4 酮康唑?qū)π∈蟛G丸組織形態(tài)學(xué)的影響

如圖 2 所示，正常組小鼠睪丸曲細(xì)精管管腔大小基本一致，管腔內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞排列整齊，且內(nèi)容有精子。組織間質(zhì)正常，無(wú)充血、出血等現(xiàn)象，為正常形態(tài)結(jié)構(gòu)。

與正常組相比，低劑量組小鼠睪丸細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化較小，曲細(xì)精管管腔內(nèi)徑略微增大，管腔內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞缺失較少；中劑量組管腔變大，各級(jí)生精細(xì)胞缺失較多，管腔內(nèi)精子數(shù)量減少；而高劑量組管腔顯著增大，各級(jí)生精細(xì)胞數(shù)量明顯減少，精子數(shù)量極少或無(wú)，損傷最為嚴(yán)重。上述結(jié)果顯示，酮康唑可誘導(dǎo)雄性小鼠生殖毒性。

Fig. 2 Testis histopathology of mice in each group(HE ×200)A： Control group； B： Low-dose group； C： Medium-dose group； D： High-dose group

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)每日皮下注射酮康唑的方法誘導(dǎo)制備小鼠肝臟與睪丸組織損傷的動(dòng)物模型。一定劑量的酮康唑可使小鼠肝臟、睪丸組織受損[13]，生理功能失調(diào)，使與其相關(guān)的特異性酶活性升高[14，15]。

作為咪唑類廣譜抗真菌藥，酮康唑的抗真菌活性強(qiáng)，其通過(guò)干擾真菌細(xì)胞膜的麥角甾醇的合成進(jìn)而增大膜通透性，最終使其失去正常的生理功能[16]。在臨床上，酮康唑主要應(yīng)用于如甲癬、體癬、鵝口瘡、脂溢性皮炎，以及陰道炎等各種深、淺部真菌感染的治療[17]。雖然酮康唑臨床療效確切，但是其所帶來(lái)的不良反應(yīng)也備受人們的關(guān)注。

肝臟是機(jī)體內(nèi)參與各種物質(zhì)代謝的重要器官，其藥物性、缺血性等損傷往往會(huì)對(duì)機(jī)體帶來(lái)嚴(yán)重影響[18，19]。藥物性肝損傷(drug-induced liver injury，DILI)，指由藥物本身或其代謝產(chǎn)物引起的肝損害，亦或由于在用藥過(guò)程中機(jī)體對(duì)藥物的敏感性或耐受性降低所致[20]。酮康唑主要在肝臟中代謝，其引發(fā)的肝功能異常與服藥時(shí)間及劑量有明顯的正比關(guān)系。ALT 主要存在于細(xì)胞質(zhì)，而 AST 主要存在于細(xì)胞質(zhì)與線粒體中，當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，AST、ALT 便會(huì)釋放入血，因此臨床上常采用檢測(cè) AST、ALT 活性的方法，以表征肝臟功能是否正常[21]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藥物組小鼠血清 AST、ALT 活性顯著升高。HE 染色表明：藥物組小鼠肝細(xì)胞水腫損傷，肝索排列混亂，肝血竇不規(guī)則。上述結(jié)果提示，酮康唑具有誘導(dǎo)小鼠肝臟損傷的作用。

眾多研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用酮康唑能夠明顯抑制腎上腺皮質(zhì)激素的合成及雄性激素的產(chǎn)生，甚至導(dǎo)致生育能力的下降、喪失[22]。Iamsaard 等研究發(fā)現(xiàn)，雄性大鼠在酮康唑的影響下，表征出明顯的生殖毒性，其生殖器官系數(shù)、睪丸激素水平和精子濃度均有明顯下降[23]。LDH是糖酵解過(guò)程中的關(guān)鍵酶，其與生精上皮的成熟密切相關(guān)；ACP 是在生殖毒性研究中被用來(lái)評(píng)價(jià)是否存在生精障礙的標(biāo)志酶，并參與睪丸內(nèi)蛋白質(zhì)合成；而 γ-GT 是睪丸支持細(xì)胞的特異性標(biāo)志酶，主要與促進(jìn)精子的成熟有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藥物組小鼠睪丸組織 γ-GT、ACP、LDH 的活性顯著下降。HE 染色可見睪丸曲細(xì)精管管腔內(nèi)徑增大，管內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞排列雜亂，數(shù)量減少。上述結(jié)果提示，酮康唑可誘導(dǎo)小鼠睪丸損傷。因此，酮康唑能導(dǎo)致小鼠肝臟、睪丸生理功能紊亂，并且隨著劑量的增大，小鼠肝臟、睪丸組織的生化指標(biāo)、病理惡化程度愈為嚴(yán)重。

在本研究中，當(dāng)酮康唑給藥劑量超過(guò)30 mg/kg時(shí)，小鼠血清AST、ALT以及睪丸組織γ-GT、ACP、LDH活性就已發(fā)生顯著性地異常改變，提示肝臟和睪丸受到了明顯的損傷。因此，為了避免肝臟及睪丸毒性的發(fā)生，需要謹(jǐn)慎的選擇酮康唑的臨床給藥劑量來(lái)確保用藥安全。到目前，有關(guān)酮康唑具有明顯肝毒性的報(bào)道十分常見，然而對(duì)睪丸的毒性報(bào)道還較少。綜上所述，本研究觀察了酮康唑?qū)π∈蟾闻K及睪丸生理功能的影響，為相關(guān)動(dòng)物模型的建立，以及臨床用藥劑量的選擇提供重要的實(shí)驗(yàn)資料。