涂容芳， 何振華， 譚小武， 陳 哲， 曾賽麗， 劉 莎， 賈遠(yuǎn)航， 李雪花

(南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院，附屬第二醫(yī)院，呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科, 湖南 衡陽 421001)

肺纖維化(pulmonary fibrosis)是一種以咳嗽、進(jìn)行性加重的呼吸困難為主要表現(xiàn)的致命性肺病，其發(fā)病原因主要與上皮/內(nèi)皮細(xì)胞損傷后出現(xiàn)異常修復(fù)有關(guān)[1]，而異常修復(fù)的關(guān)鍵標(biāo)志是“成纖維細(xì)胞灶形成”[2]。目前關(guān)于成纖維細(xì)胞灶形成來源有：成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化(fibroblast，F(xiàn)B)、上皮間質(zhì)變(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、內(nèi)皮間質(zhì)變(endothelial-mesenchymal transition，EnMT)、血液循環(huán)纖維細(xì)胞四種學(xué)說，其中EnMT過程占成纖維細(xì)胞灶來源的30%以上，是近年研究的熱點[3，4]。肺纖維化預(yù)后不佳、死亡率高，嚴(yán)重危害人類健康，依據(jù)2019年間質(zhì)性肺炎指南目前除了肺移植，無特效藥物。隨著研究進(jìn)展，近年來吡啡尼酮、尼達(dá)尼布化藥物相繼問世，但其臨床效果不確切、價格昂貴且副作用大，臨床難以實施。他汀類藥物臨床作用廣泛且價格便宜、副作用小，深入探究其抗纖維化機制，可為新型抗纖維化藥物的研發(fā)提供新的理論依據(jù)。本實驗用博來霉素(bleomycin, BLM)氣管內(nèi)給藥復(fù)制肺纖維化模型，通過觀察辛伐他汀對大鼠肺纖維化及其EnMT過程中VE-cad(VE-cadherin)、VIM(vimentin)、α-SMA(alpha-smooth muscle actin)的表達(dá)變化，從而探討辛伐他汀對肺纖維化EnMT過程的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑

注射用鹽酸博萊霉素：日本化藥株式會社生產(chǎn)(每支15 mg)；辛伐他汀片：杭州默沙東制藥有限公司(20 mg*7 片/盒)。鼠抗人VE-cad 單克隆、VIM及α-SMA多克隆抗體分別購自美國R&D、ABZOOM和Epitomics公司。

1.2 動物分組及纖維化模型建立

體重為200～250 g的健康大鼠(雄性SD)共60只，隨機分為：對照組(A 組)、造模組(B 組)、辛伐他汀5 mg治療組(C 組)和辛伐他汀10 mg治療組(D 組)，各組15只。各大鼠稱重后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(2.5 ml/kg)，仰臥固定于鼠臺上，頸部酒精消毒后逐層分離并暴露氣管，注射器經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙朝向心端刺入氣管，予B、C、D組注入博萊霉素生理鹽水溶液(5 mg/kg ) 復(fù)制肺纖維化模型，A組注入相應(yīng)生理鹽水溶液，縫合皮膚待動物自然清醒后放置籠內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)。C、D 組于造模第1日起每天分別胃內(nèi)灌注辛伐他汀混懸液5 mg /(kg·d)及辛伐他汀混懸液10 mg /(kg·d)；A組和B 組每天胃內(nèi)灌注等體積的生理鹽水10 ml /(kg·d)。

1.3 標(biāo)本處理

造模后第7、14、28日以頸動脈放血法隨機處死每組大鼠5只。分離氣管和雙肺，取左側(cè)完整肺葉置于經(jīng)焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水處理的4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，用于Masson染色和免疫組織化學(xué)檢測。取右肺下葉切成小塊保存于DEPC水處理過的EP管中，予以液氮瞬間冷凍后轉(zhuǎn)移到-196℃液氮保存，用于進(jìn)行HYP、RT-PCR測定。

1.4 Masson染色

石蠟切片脫蠟等常規(guī)處理后使用Masson 麗春紅酸性復(fù)紅液中染色5～10 min，經(jīng)1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min，以1%亮綠酸性液染膠原纖維至綠色3～5 min，最后用95%酒精和無水乙醇脫色，二甲苯透明，中性樹膠封片固定后置于電子顯微鏡下觀察。

1.5 測定各組肺組織HYP含量

1.6 測定各組大鼠肺組織血管新生及內(nèi)皮間質(zhì)變相關(guān)蛋白的表達(dá)

按常規(guī)流程制作肺組織石蠟標(biāo)本并包埋，切片機下切成4 μm左右薄片，按照免疫組化方法(鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法，SP 法)及試劑盒要求，依次滴加相應(yīng)抗體，然后對切片依次行顯色-脫水-透明-封固-鏡檢等操作，陰性對照中采用PBS替代一抗行相同操作。采用Weidner 微血管計數(shù)法，計算切片的微血管密度(MVD)來測定血管新生情況；測定各組VE-Cad、VIM、α-SMA蛋白表達(dá)。

1.7 測定肺組織中內(nèi)皮間質(zhì)變相關(guān)mRNA的表達(dá)

依照試劑盒要求提取總RNA并合成cDNA，按相應(yīng)條件加入各指標(biāo)引物并擴增：其中VE-cad序列F1：GCGACTACCAGGACGCTTTCA 及R1：CATGTATCGGAGG TCGATGGTG，退火溫度56℃，擴增產(chǎn)物長度為149 bp；VIM序列F1：AGGCAAAGCAGGAGTCAAAC及R1：TCTTCCATTTCACGCATCTG，退火溫度55℃，增產(chǎn)物長度為115 bp；α-SMA 序列 F1：TTCCTTCGTGACTACTGCTGAG及R1：CAATGAAAGATGGCTGGAAGAG，退火溫度54℃，擴增長度為209 bp；β-actin序列F1: TCAGGTCATCACTATCGGCAAT 及R1: AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA，退火溫度55℃，擴增長度為432 bp。取擴增產(chǎn)物5 μl 經(jīng)1.5%的瓊脂凝膠電泳，測設(shè)擴增條帶的吸光光度值。每個樣本重復(fù)反應(yīng)3次，取平均 CT 值(閾值循環(huán)數(shù))作為每個樣本的CT 值。采用相對定量 2-△△CT法進(jìn)行mRNA相對表達(dá)量比較，以folds=2-△△CT表示為BLM造模組較正常組基因的相對表達(dá)倍數(shù)，△CT=CT (目的)-CT (內(nèi)參) ；△△CT=△CT (治療組)-△CT (對照組)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 辛伐他汀對大鼠肺組織形態(tài)的影響

A組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡間隔和細(xì)支氣管壁周圍有少量膠原纖維沉著，余支氣管壁周圍未見明顯膠原纖維。B、C、D組大鼠肺組織在7 d、14 d、28 d均存在不同程度肺泡組織結(jié)構(gòu)破壞，部分肺泡腔融合轉(zhuǎn)變?yōu)槟覡罨蚓W(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且在各級支氣管、血管及肺間質(zhì)周圍可見藍(lán)綠色膠原纖維沉積，提示肺纖維化發(fā)生。與B組相應(yīng)時間點比較，C、D組大鼠肺組織在結(jié)構(gòu)破壞或轉(zhuǎn)變、膠原沉積方面均有不同程度的改善或減輕，且D組改善比C組明顯，提示辛伐他汀可減輕肺纖維化程度，且辛伐他汀10 mg組比5 mg組減輕明顯(圖1)。

Fig. 1 Masson staining in lung tissues of rats at the 28th day (×400)

2.2 辛伐他汀對大鼠肺組織Hyp及MVD的影響

與 A 組相比，B、C、D組大鼠肺組織的Hyp含量、MVD值在 7 d、14 d、28 d均有上升，其中B組28 d最明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示博來霉素可增加大鼠肺組織的Hyp含量及血管新生。相應(yīng)條件加入辛伐他汀干預(yù)后C 組、D 組Hyp含量和MVD值在各時間點對比B組呈下降趨勢，其中D組下降程度大于C組，以D組28 d最明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，提示辛伐他汀可降低大鼠肺組織Hyp含量、減輕血管新生程度，且辛伐他汀10 mg組比5 mg組降低明顯(表1)。

Tab. 1 The Hyp contents and MVD n=5)

2.3 辛伐他汀對大鼠肺組織VE-cad蛋白及mRNA的影響

與A 組比較，B、C、D組VE-cad蛋白和mRNA含量在各時間點呈下降趨勢，其中 B組28 d時最明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示博來霉素可降低大鼠肺組織VE-cad蛋白和mRNA含量；相應(yīng)條件加入辛伐他汀干預(yù)后， C、D組VE-cad蛋白和mRNA含量在各時間點對比B組呈上升趨勢(P< 0.05)，其中D組增加程度大于C組，以D組28 d增加最明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，提示辛伐他汀可增強VE-cad蛋白和mRNA表達(dá)，且辛伐他汀10 mg組比5 mg組增強明顯(圖2，圖3，表2)。

Fig. 2 Immunohistochemistry of VE-cad in lung tissues at the 28th day (×400)

Fig. 3 The mRNA expressions of VE-cad, VIM and α-SMA in lung tissues of ratsM： DNA MAKE； A： Control group； B： Bleomycin group； C： 5 mg SIM group； D： 10 mg SIM group

2.4 辛伐他汀對大鼠肺組織VIM、α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)的影響

與A組比較，B 、C、D組VIM、α-SMA蛋白和mRNA含量在各時間點呈上升趨勢，其中B組28 d升高最明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，提示博來霉素可增強大鼠肺組織VIM、α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)；相應(yīng)條件加入辛伐他汀干預(yù)后，C、D組VIM、α-SMA蛋白和mRNA含量在各時間點對比B組呈下降趨勢，其中D組下降程度大于C組，以D組下降28 d最明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均< 0.05)，提示辛伐他汀可減少大鼠肺組織VIM、α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)，且辛伐他汀10 mg組比5 mg組減輕明顯(圖3，圖4，圖5，表3，表4)。

Fig. 4 Immunohistochemistry of VIM in lung tissues at the 28th day (×400)

Fig. 5 Immunohistochemistry of α-SMA in lung tissues at the 28th day (×400)A： Control group； B： Bleomycin group； C： 5 mg SIM group； D： 10 mg SIM group

Tab. 2 The protein and mRNA expressions of VE-cad in lung tissues of n=5)

Tab. 3 The protein and mRNA expressions of VIM in lung tissues of n=5)

Tab. 4 The protein and mRNA expressions of α-SMA in lung tissues of n=5)

3 討論

傳統(tǒng)認(rèn)為，辛伐他汀屬于降脂藥物，但近年來越來越多研究發(fā)現(xiàn)其還有抗纖維化作用，具體機制尚未完全闡明。有體外試驗發(fā)現(xiàn)，其可改變血管通透性及血管粘附，誘導(dǎo)人肺成纖維細(xì)胞凋亡[5]；Weis等在動物實驗則顯示其可減少肉芽組織生成、誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡，主要機制與影響內(nèi)皮細(xì)胞增殖以及血管新生有關(guān)[6]。本研究通過博來霉素一次性氣管內(nèi)注射復(fù)制大鼠肺纖維化模型[7]，Masson染色觀察大鼠肺組織形態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與A組相比，B、C、D組大鼠肺肺泡組織均出現(xiàn)結(jié)構(gòu)破壞并融合形成囊狀或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且在肺間質(zhì)周圍可見藍(lán)綠色膠原纖維沉積；通過堿性水解法檢測各組大鼠肺組織中HYP含量及MVD值發(fā)現(xiàn)與A組相比，B、C、D組大鼠肺組織的Hyp含量、MVD值在各時間點均有升高，以B組28 d最明顯，提示博來霉素致肺纖維化模型造模成功且出現(xiàn)血管新生。辛伐他汀干預(yù)后，C、D組大鼠肺組織在結(jié)構(gòu)破壞或轉(zhuǎn)變、膠原沉積方面均有不同程度減輕，且D組改善比C組明顯；進(jìn)一步檢測HYP含量及MVD值發(fā)現(xiàn)C 組、D 組Hyp含量和MVD值在各時間點較B組均有下降，D組下降程度大于C組，以D組28 d下降最明顯，提示辛伐他汀可降低肺纖維程度，且辛伐他汀10 mg組效果優(yōu)于5 mg組，其過程可能與抑制血管新生有關(guān)。而內(nèi)皮細(xì)胞是血管新生的關(guān)鍵細(xì)胞，于是我們推測其可能主要通過影響EnMT過程減少肺纖維化形成。

EnMT是指內(nèi)皮細(xì)胞在細(xì)胞因子如TGF-β1等介導(dǎo)下失去其特定的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物如CD31、Tie-2和VE-Cad，獲得間充質(zhì)或肌纖維母細(xì)胞表型如α-SMA，VIM和I型膠原能力的生物過程[8，9]。EnMT最先發(fā)現(xiàn)于胚胎心臟形成過程，隨后大量研究發(fā)現(xiàn)其可發(fā)生在出生后許多病理過程如癌癥、心包纖維化、腎臟纖維化及類癌纖維相關(guān)疾病中[10，11]。近來研究表明內(nèi)皮間質(zhì)變與肺纖維化疾病密切相關(guān)，是成纖維化細(xì)胞灶的重要來源之一。蔣榮[12]等發(fā)現(xiàn)二氧化硅可誘導(dǎo)成纖維化細(xì)胞通過內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積及矽肺纖維化形成。Hashimoto[13]等在研究血管內(nèi)皮細(xì)胞是否可以作為肺纖維化發(fā)展來源時，在雙轉(zhuǎn)基因小鼠(即內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物L(fēng)acZ可在血管內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞來源的任何細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá))進(jìn)行氣管內(nèi)注射博萊霉素建造肺纖維化模型后，用形態(tài)學(xué)評價法觀察成纖維化斑中內(nèi)皮細(xì)胞來源的纖維細(xì)胞數(shù)目(即LacZ陽性)，結(jié)果LacZ 檢測顯示成纖維細(xì)胞灶中約16%是內(nèi)皮細(xì)胞來源，且這種細(xì)胞可表達(dá)I型膠原蛋白、VIM和α-SMA。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)EndMT不僅可通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞，還會造成血管新生，使毛細(xì)血管床密度減少，加重組織缺氧、缺血，促進(jìn)肺纖維化形成。Jiang Y[14]和Sabbineni H[15]等在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)和人原發(fā)性肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞(HPAECs) 中發(fā)現(xiàn)TGF-β1刺激后可通過增強間充質(zhì)標(biāo)記物N-cadherin和α-SMA表達(dá)，減少內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物VE-Cad和eNOS的表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞模型中內(nèi)皮細(xì)胞遷移并轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蟹置谀z原蛋白及細(xì)胞外基質(zhì)特征的成纖維細(xì)胞，從而促進(jìn)纖維化發(fā)生。VE-cad屬于鈣依賴粘附素家族成員之一，主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，大量研究表明其可通過介導(dǎo)細(xì)胞粘附、維持血管通透性，在血管發(fā)生、形成及血管內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中起著重要作用[16]。VIM主要存在于中胚層起源的內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和白細(xì)胞，可通過微管、微絲參與支撐細(xì)胞支架網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)從而達(dá)到維持細(xì)胞完整性作用。α-SMA[17]主要存在于肌成纖維細(xì)胞，在一定程度上能反映肺組織中的膠原沉積以及肌成纖維細(xì)胞的合成情況。本實驗通過SP及PCR法測定BLM致大鼠肺纖維化模型中VE-cad、VIM和α-SMA的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，BLM組從7 d開始內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物VE-cad的蛋白和mRNA水平均出現(xiàn)持續(xù)降低；而間質(zhì)標(biāo)志物VIM、α-SMA的蛋白和mRNA水平不斷增強，具有內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物特征的細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂虚g質(zhì)標(biāo)志物特征細(xì)胞，提示模型組大鼠肺組織造模成功并出現(xiàn)了EnMT改變，由此進(jìn)一步證實EnMT為肺纖維化發(fā)生重要過程，阻斷該過程有可能會減輕肺纖維。辛伐他汀干預(yù)后VE-cad蛋白和mRNA含量在各時間點對比B組呈上升趨勢，VIM、α-SMA蛋白和mRNA含量在各時間點對比B組呈下降趨勢，且D組增加或降低程度大于C組，以D組28 d增加或減少最明顯；提示辛伐他汀可有效增加VE-cad蛋白和mRNA含量、降低大鼠肺組織VIM、α-SMA蛋白及mRNA含量，且辛伐他汀10 mg組療效優(yōu)于5 mg組，由此，我們推測辛伐他汀抗纖維化機制可能與增強VE-cad表達(dá)，降低VIM及α-SMA表達(dá)，減少EnMT 發(fā)生有關(guān)。

綜上所述，辛伐他汀有望作為一種新型抗肺纖維化藥物，其可能通過影響EnMT過程、抑制內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變而減輕肺纖維化，其作用途徑可能與TGF-β /Smads 、Notch、Wnt /β-catenin 或mTOR等信號通路有關(guān)，具體作用機制有待進(jìn)一步研究證實。