王小琴， 石 卉， 方小霞， 彭聿平

(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系， 江蘇 南通 226001)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 (rheumatoid arthritis, RA) 是一種自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨的破壞，關(guān)節(jié)血管翳的形成以及免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)等關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)。RA的發(fā)病機(jī)制還不是很明確，但有研究提示CD4+T細(xì)胞在RA的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[1，2]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 (regulatory T, Treg) 是CD4+T細(xì)胞的一個(gè)亞群[3]，主要分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 (transforming growth factor, TGF)-β和IL-10，是體內(nèi)具有免疫抑制功能的異質(zhì)性細(xì)胞群，在維持外周免疫耐受中起重要作用，其數(shù)量減少或功能缺失可導(dǎo)致炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。

去甲腎上腺素 (norepinephrine, NE)是兒茶酚胺的一種，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)兒茶酚胺可以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能。外周神經(jīng)系統(tǒng)的交感神經(jīng)纖維釋放的神經(jīng)遞質(zhì)是NE。有研究表明，交感神經(jīng)釋放的NE在濃度較高時(shí)具有抗炎作用[4,5]。在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎 (collagen induced arthritis, CIA)早期，交感神經(jīng)加重疾病癥狀，而疾病晚期，交感神經(jīng)可改善關(guān)節(jié)炎癥狀[6,7]。CIA是當(dāng)前研究RA較理想和最為常用的動(dòng)物模型。闡明交感神經(jīng)釋放的神經(jīng)遞質(zhì)NE對(duì)CIA小鼠模型中Treg細(xì)胞的作用可以更好地理解交感神經(jīng)在RA中的作用，但NE對(duì)CIA小鼠模型中Treg細(xì)胞的作用還不是很清楚。有研究顯示，NE 通過(guò)免疫細(xì)胞上的腎上腺素受體 (adrenoreceptor，AR) 調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和細(xì)胞因子的產(chǎn)生[8]。我們實(shí)驗(yàn)室以前的研究表明，T淋巴細(xì)胞可以表達(dá)α1-AR，兒茶酚胺可以通過(guò)激活α1-AR促進(jìn)Th1細(xì)胞向Th2細(xì)胞方向分化[9]。本研究中，我們利用CIA模型小鼠，探討NE及其α1-AR 對(duì)CIA小鼠Treg細(xì)胞的作用，希望可以為RA這一疾病提供新的治療方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF級(jí)DBA /1小鼠 (購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司) 32只，8～10 周齡，平均體質(zhì)量為 (18±2) g，隨機(jī)分為對(duì)照組 (n=8) 和CIA模型組 (n=24)。室內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后用于實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組安靜飼養(yǎng)，CIA組進(jìn)行模型制備。

1.2 試劑

雞II型膠原 (collagen II，CII) 購(gòu)于Sigma公司；佛氏完全佐劑 (complete freund’s adjuvant，CFA) 購(gòu)于Chondrex公司；脂多糖 (lipopolysaccha-ride，LPS) 購(gòu)于Sigma公司；小鼠CD4磁珠分選試劑盒，購(gòu)自Miltenyi Biotec公司；TGF-β、IL-10、β-actin抗體均購(gòu)于Santacruz公司；抗α1-AR、CD4抗體，購(gòu)自Abcam公司；PE標(biāo)記的抗CD25抗體、APC標(biāo)記的抗Foxp3抗體均購(gòu)于BD公司；α1-AR 激動(dòng)劑苯腎上腺素 (phenylephrine)，購(gòu)自Abcam公司。

1.3 CIA小鼠模型制備及模型成功制備的判定標(biāo)準(zhǔn)

第 0 日，在雄性DBA/J小鼠尾根部多點(diǎn)注射含有 100 μg CII的膠原乳劑100 μl，初次免疫后第 21 日，在小鼠腹腔注射相同的膠原乳劑 100 μl，初次免疫后第 28 日，在小鼠腹腔注射溶于 20 μl PBS的LPS 20 μg以加速關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。從初次免疫后第21日開(kāi)始，每隔2日對(duì)每只小鼠四個(gè)足爪進(jìn)行評(píng)分直至觀察的最后一天即初次免疫后第41日。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[10]如下：0分：無(wú)紅腫；1分：輕度的紅和腫；2：顯著的皮膚發(fā)紅和關(guān)節(jié)腫脹；3分：關(guān)節(jié)僵硬，肢體活動(dòng)受限。四只足爪均被評(píng)分，每只小鼠最高分為12分。評(píng)分者為與實(shí)驗(yàn)不相關(guān)的第三者。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)盡量保持實(shí)驗(yàn)條件 (測(cè)試者、測(cè)試時(shí)間、實(shí)驗(yàn)環(huán)境等) 的一致性，盡量減少實(shí)驗(yàn)的干擾因素。

1.4 CIA小鼠踝關(guān)節(jié)寬度和后足厚度的測(cè)量

在初次免疫后第 41 日，用千分尺測(cè)量小鼠踝關(guān)節(jié)寬度和后足厚度。測(cè)量者為與實(shí)驗(yàn)不相關(guān)的第三者。

1.5 ELISA法檢測(cè)血清中抗 CII IgG 抗體水平

初次免疫后第 41 日，對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉、眼靜脈取血，37℃ 靜置 1 h，離心 (3 000 r/min, 15 min)，取血清，-20℃保存。CII 包被 96 孔 ELISA 培養(yǎng)板。根據(jù)文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 CD4+ T細(xì)胞磁珠分選及藥物處理

在初次免疫后第 41 日，無(wú)菌取CIA小鼠脾臟，分離淋巴細(xì)胞。用CD4+T細(xì)胞磁珠分選出CD4+T細(xì)胞。得到的細(xì)胞按 1×107cells/ml 密度種于培養(yǎng)板中，加抗小鼠CD3、CD28單克隆抗體 (1 μg/ml) 置于 37℃，5% CO2，飽和濕度下培養(yǎng) 48 h，誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞增殖。將NE或α1-AR激動(dòng)劑phenylephrine加入到活化的CD4+T細(xì)胞中，使其終濃度分別達(dá)到 10-5mol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+ T細(xì)胞中Treg細(xì)胞數(shù)目的變化

NE處理 24 h 后的CD4+T細(xì)胞中，加入PE標(biāo)記的抗CD25抗體、APC標(biāo)記的抗Foxp3抗體, 利用BD公司FACS Calibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)

取CIA小鼠踝關(guān)節(jié)或脾臟或NE處理 24 h 后的CD4+T細(xì)胞，提取組織或細(xì)胞蛋白，進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定，每孔上樣量 100 μg，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酞胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜。室溫封閉 2 h 后孵抗TGF-β抗體 (1∶200)、抗IL-10抗體 (1∶200)、抗α1-AR抗體 (1∶200) 或抗β-actin抗體 (1∶5 000)，4℃包被過(guò)夜，熒光標(biāo)記羊抗小鼠IgG (1∶5 000) 或熒光標(biāo)記羊抗兔IgG (1∶5 000) 室溫孵育 1 h 后Odyssey雙紅外激光掃描系統(tǒng)掃描并分析。

1.9 免疫熒光染色

初次免疫后第 41 日，取材固定對(duì)照和CIA小鼠脾臟切片 (25 μm)，加山羊血清封閉 30 min，加入抗CD4和抗α1-AR抗體，4℃孵育過(guò)夜，加入特異性標(biāo)記的二抗，室溫孵育 4 h，PBS漂洗，甘油封片, 熒光顯微鏡下觀察。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 CIA小鼠的臨床評(píng)分、踝關(guān)節(jié)寬度和后足厚度及血清中抗 CII IgG 抗體水平的變化

小鼠經(jīng) CII 免疫后第 31 日開(kāi)始，開(kāi)始出現(xiàn)多關(guān)節(jié)腫脹等關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)，臨床評(píng)分顯著升高。對(duì)照組小鼠臨床評(píng)分為0。與對(duì)照組相比，CIA 小鼠的踝關(guān)節(jié)寬度和后足厚度明顯增加。CIA 小鼠血清中抗 CII IgG 抗體的水平明顯高于對(duì)照組 (表1)。

Tab. 1 Clinical score, ankle joint and rear paw thickness and anti-CII IgG level in serum in CIA mice n=8)

2.2 NE對(duì)CIA小鼠CD4+ T細(xì)胞中Treg細(xì)胞功能的影響

為了說(shuō)明NE對(duì)CIA小鼠CD4+T細(xì)胞亞群Treg細(xì)胞的作用，我們分離出CIA小鼠脾臟的淋巴細(xì)胞并分選活化CD4+T細(xì)胞，并在細(xì)胞中加入NE。首先用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了CIA小鼠CD4+T細(xì)胞中Treg細(xì)胞數(shù)目的變化，CD25+Foxp3+細(xì)胞代表Treg細(xì)胞。結(jié)果顯示，在CIA小鼠中，與未加藥組相比，NE加入后的CD4+T細(xì)胞中CD25+Foxp3+(Treg) 細(xì)胞的百分比顯著增加 (圖1A，表2)。其次，我們檢測(cè)了CIA小鼠CD4+T細(xì)胞中TGF-β和IL-10的蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示，在CIA小鼠中，與未加藥組相比，NE加入后的CD4+T細(xì)胞中TGF-β和IL-10的蛋白表達(dá)水平顯著增加 (圖1B，表2)。

Fig. 1 Effects of NE on Treg cell function in CD4+ T cells of CIA miceA: Representative fluorescent dot images showing Treg cells by flow cytometric analysis； B: Treg-specific cytokine protein expression in CD4+ T cells of CIA mice was assessed by Western blot analysis； CIA: Collagen-induced arthritis； NE: Norepinephrine

Tab. 2 Effects of NE on Treg cell number and TGF-β and IL-10 protein expressions in CD4+ T cells of CIA n=4)

2.3 CIA小鼠炎性組織中α1-AR表達(dá)的變化

為了說(shuō)明CD4+T細(xì)胞能否表達(dá)α1-AR，我們用免疫熒光染色法檢測(cè)對(duì)照組和CIA模型組脾臟中CD4與α1-AR表達(dá)的情況。結(jié)果顯示，對(duì)照組和CIA模型組脾臟中均有CD4單陽(yáng)性與α1-AR單陽(yáng)性細(xì)胞的存在，且均有CD4與α1-AR共定位的雙陽(yáng)性細(xì)胞的存在，說(shuō)明CD4+T細(xì)胞能夠表達(dá)α1-AR (圖2A)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，我們檢測(cè)了對(duì)照組和CIA模型組踝關(guān)節(jié)和脾臟中α1-AR的蛋白表達(dá)的變化。研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，CIA小鼠踝關(guān)節(jié)和脾臟中α1-AR的蛋白表達(dá)顯著降低 (圖2B，表3)。

Fig. 2 α1-AR is expressed by CD4+ T cells and α1-AR protein expression in the ankle and spleenA: Immunofluorescence staining of the spleen sections. The arrows point to the typical cells of co-expressing CD4 and α1-AR (×40)； B: α1-AR protein expression in the ankle and spleen were assessed by Western blot analysis； CIA: Collagen-induced arthritis

Tab. 3 Quantitative analysis of α1-AR protein expressions in ankle joints and spleen of CIA mice n=4)

2.4 α1-AR激動(dòng)劑對(duì)CIA小鼠CD4+ T細(xì)胞中Treg細(xì)胞功能的影響

為了說(shuō)明α1-AR在CIA小鼠CD4+T細(xì)胞中的作用，我們將α1-AR激動(dòng)劑phenylephrine加入CIA小鼠的CD4+T細(xì)胞中，并檢測(cè)了TGF-β和IL-10的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在CIA小鼠中，與未加藥組相比，α1-AR激動(dòng)劑phenylephrine加入后的CD4+T細(xì)胞中TGF-β和IL-10的表達(dá)水平顯著增加 (圖3，表4)。

Fig. 3 Effects of α1-AR agonist on Treg-specific cytokine expression in CD4+ T cellsCIA: Collagen-induced arthritis； Phen: Phenylephrine

Tab. 4 Quantitative analysis of TGF-β and IL-10 protein expressions in CD4+ T cells of CIA mice n=4)

3 討論

本研究中，用CII免疫小鼠，關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫，小鼠四肢臨床評(píng)分顯著增加。CIA模型小鼠血清中抗CII-IgG抗體顯著高于對(duì)照組。在RA早期患者血清中抗CII特異性抗體顯著增加[12]。在一些CIA實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭幸沧C實(shí)血清中抗CII特異性抗體的升高是關(guān)節(jié)炎性疾病的反應(yīng)[5]。說(shuō)明我們成功制備了CIA 小鼠模型。

在抗原刺激下，NE從交感神經(jīng)末梢釋放到淋巴組織中，對(duì)免疫細(xì)胞發(fā)揮作用。有研究表明，NE能夠抑制樹(shù)突狀細(xì)胞或單核細(xì)胞中的致炎因子TNF，IL-1，IL-6 和 IL-12的產(chǎn)生，而增加抗炎因子IL-10的產(chǎn)生[13]。有研究報(bào)道，Treg細(xì)胞的缺失或者功能下調(diào)可以導(dǎo)致多種自身免疫性疾病的發(fā)生。Treg細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生的抗炎細(xì)胞因子TGF-β和IL-10抑制自身免疫的T細(xì)胞的損傷[14]，以達(dá)到控制自身免疫性疾病的進(jìn)展、治療患者的目的。此外，早期RA患者外周血中 Treg比率降低，經(jīng)相關(guān)藥物治療后，外周血中Treg數(shù)量明顯回升，其免疫抑制功能也得以恢復(fù)[15-17]。這些研究提示，Treg細(xì)胞在RA中發(fā)揮著抗炎作用。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)CIA小鼠的CD4+T細(xì)胞經(jīng)NE處理后，Treg細(xì)胞的百分比顯著增加，TGF-β和IL-10的蛋白表達(dá)水平顯著增加，提示NE可增強(qiáng)CIA小鼠CD4+T細(xì)胞中Treg細(xì)胞的功能，促進(jìn)CIA 小鼠的CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞方向分化，進(jìn)而說(shuō)明NE在CIA小鼠中具有增強(qiáng)抗炎反應(yīng)的作用。NE對(duì)免疫系統(tǒng)的影響主要通過(guò)ARs來(lái)實(shí)現(xiàn)的。既往研究表明，α1-AR介導(dǎo)了兒茶酚胺誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡和Th1細(xì)胞向Th2細(xì)胞方向的分化[9,18]。這些研究提示，α1-AR在介導(dǎo)NE的免疫調(diào)節(jié)功能中發(fā)揮著重要作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，在RA中，交感神經(jīng)系統(tǒng)通過(guò)α1-AR的活化來(lái)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能[19]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和CIA組小鼠脾臟中均有CD4與α1-AR共定位的雙陽(yáng)性細(xì)胞的存在，說(shuō)明CD4+T細(xì)胞能夠表達(dá)α1-AR。此外，CIA小鼠踝關(guān)節(jié)和脾臟中α1-AR的蛋白表達(dá)顯著降低，提示α1-AR參與了CIA的免疫應(yīng)答。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)α1-AR激動(dòng)劑phenylephrine顯著增加CIA小鼠CD4+T細(xì)胞中TGF-β和IL-10的蛋白表達(dá)水平，提示激活CIA小鼠CD4+T細(xì)胞上α1-AR可增強(qiáng)CD4+T細(xì)胞中Treg細(xì)胞的功能，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞方向分化。以上結(jié)果提示，NE可通過(guò)激活CIA小鼠CD4+T細(xì)胞上的α1-AR，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞朝向Treg細(xì)胞分化，但具體的作用機(jī)制還需要通過(guò)深入的實(shí)驗(yàn)來(lái)探討。

綜上所述，CIA 小鼠臨床評(píng)分、踝關(guān)節(jié)寬度和后足厚度及血清中抗 CII IgG 抗體水平升高。CIA小鼠α1-AR的表達(dá)水平顯著降低；NE可通過(guò)激活CIA小鼠CD4+T細(xì)胞上的α1-AR增強(qiáng)CIA小鼠CD4+T細(xì)胞中Treg細(xì)胞的功能，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞朝向Treg細(xì)胞分化，從而發(fā)揮抗炎作用。上述研究，可為RA的治療方案提供一定的研究空間。