曹雪改，葉立紅，張海叢，王志華，王翀奎

(1. 石家莊市藁城中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 藁城 052160；2. 石家莊市第五醫(yī)院，河北 石家莊 050021；3. 河北中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，河北 石家莊 050000)

膽管消失綜合征(vanishing bileduct Syndrome,VBDS)是由于多種因素引起的肝內(nèi)部分膽管樹持續(xù)進(jìn)行性破壞后出現(xiàn)的一種病理形態(tài)特征， 當(dāng)肝穿標(biāo)本中匯管區(qū)小動(dòng)脈伴行的小葉間膽管消失>50%時(shí)定義為VBDS[1]。臨床以膽汁淤積為主要表現(xiàn)，長(zhǎng)期持續(xù)膽管消失、膽汁淤積可導(dǎo)致膽汁性肝纖維化、肝硬化，甚至肝衰竭的發(fā)生，是臨床中治療比較棘手的一類疾病。位于肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜側(cè)上跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白膽汁酸鹽輸出泵(BSEP)、多藥耐藥相關(guān)蛋白2(MRP2)及多藥耐藥相關(guān)蛋白3(MRP3)在膽汁分泌過程中發(fā)揮了重要作用。當(dāng)長(zhǎng)期膽管損傷、膽汁淤積時(shí)，理論上機(jī)體將通過自身調(diào)節(jié)機(jī)制促進(jìn)負(fù)責(zé)膽汁分泌的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)，從而緩解長(zhǎng)期慢性膽汁淤積的狀態(tài)。但目前針對(duì)BSEP、MRP2及MDR3與VBDS肝病關(guān)系的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。因此，本課題觀察了BSEP、MRP2及MDR3在VBDS患者肝組織中表達(dá)及分布特點(diǎn)，分析三者表達(dá)強(qiáng)弱與VBDS不同病理形態(tài)之間的關(guān)系；從而探討影響膽汁分泌的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在VBDS患者肝組織中的表達(dá)變化及作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 采用回顧性研究方法，收集2010年1月—2019年12月在石家莊市藁城中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院和石家莊市第五醫(yī)院經(jīng)肝穿組織病理明確診斷為VBDS患者85例，患者均有堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)水平升高，排除各型病毒感染、原發(fā)性硬化性膽管炎、化膿性膽管炎、大膽管梗阻、缺血性膽管損傷、a-抗胰蛋白酶缺乏癥、Caroli病、肝移植后排異反應(yīng)等。根據(jù)引起VBDS病因不同分為藥物性肝損傷引起的VBDS組(D-VBDS)和原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cirrhosis，PBC)引起的VBDS(P-VBDS)組，其中D-VBDS組42例，均有明確的用藥史；P-VBDS組43例，同時(shí)伴AMA、AMA-M2陽性。同時(shí)選取15例無膽管消失的乙肝攜帶者作為對(duì)照組。本研究方案經(jīng)石家莊市第五醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(SJZWY2020018)，所納入患者均簽署知情同意書。

1.2試劑與儀器 免疫組化試劑盒(PV-6000)、DAB顯色液、抗體稀釋液購(gòu)自北京中杉金橋試劑公司， BSEP(ABCB11)鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，MRP2(ABCC2) 兔單克隆抗體、MDR3(ABCB4)兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，主要儀器為Image-Proplus6.0(IPP)圖像分析軟件、美智Powerlmager Version5.3圖像采集系統(tǒng)及OLYMPUS BX53顯微鏡。

1.3研究方法 詳細(xì)收集所有入選病例的一般資料(年齡、性別)、血清學(xué)指標(biāo)等，對(duì)肝組織進(jìn)行病理觀察，記錄肝細(xì)胞淤膽、毛細(xì)膽管淤膽、小葉內(nèi)炎癥、小膽管損傷、細(xì)膽管增生、匯管區(qū)炎癥6項(xiàng)病理形態(tài)特點(diǎn)并進(jìn)行半定量評(píng)分，觀察 D-VBDS組和P-VBDS組患者肝組織中 BSEP、MRP2、MDR3免疫組化陽性表達(dá)特點(diǎn)，并與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比分析；同時(shí)分析 D-VBDS組和P-VBDS組間不同病理形態(tài)與BSEP、MRP2、MDR3評(píng)分之間的相關(guān)性。

1.3.1肝組織常規(guī)病理檢測(cè) 患者均在超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮肝穿刺活取材，肝穿刺標(biāo)本長(zhǎng)度>1．0 cm。肝穿標(biāo)本均進(jìn)行連續(xù)切片，常規(guī)進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色、網(wǎng)狀纖維+Masson染色、淀粉酶消化過碘酸希夫法染色(D-PAS)、CK7/CK19免疫組化染色。病理形態(tài)觀察及半定量評(píng)分由兩名高級(jí)職稱病理醫(yī)師共同進(jìn)行。

1.3.2肝組織BSEP、MRP2、MDR3免疫組化檢測(cè)及結(jié)果判定 石蠟切片脫蠟至水，免疫組織化學(xué)染色嚴(yán)格按照SP法操作，一抗BSEP、MRP2及MDR3以適當(dāng)比例(BSEP 1∶500、MRP2 1∶300、MDR3 1∶600)稀釋滴加， PBS 代替第一抗體作為陰性對(duì)照。BSEP、MDR3、MRP2均表達(dá)于肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜側(cè)，因此免疫組化染色以在肝細(xì)胞膽管膜上出現(xiàn)棕黃色為陽性表達(dá)，無著色為陰性表達(dá)。

1.3.3肝組織病理形態(tài)學(xué)半定量評(píng)分 根據(jù)相關(guān)指南及文獻(xiàn)[2]， 選取上述6項(xiàng)病理形態(tài)作為觀察指標(biāo)，制定總分為18分的病理評(píng)分系統(tǒng)，并對(duì)每項(xiàng)病理指標(biāo)根據(jù)病變程度進(jìn)行半定量評(píng)分。

1.3.4肝組織BSEP、MRP2、MDR3半定量評(píng)分所有切片圖像采集均在完全相同顯微鏡條件下拍攝，并對(duì)圖像分析軟件設(shè)定統(tǒng)一選色參數(shù)。應(yīng)用軟件分別測(cè)量BSEP、MRP2、MDR3在每張切片的陽性區(qū)域面積、平均光密度值、積分光密度值(integrated optical density，IOD)，IOD=陽性區(qū)域面積×平均光密度值。測(cè)量得到IOD數(shù)據(jù)作為半定量分析的有效指標(biāo)。

2 結(jié) 果

2.1性別及年齡構(gòu)成 D-VBDS組42例，女33例(78.6%)，男9例(21.4%)；發(fā)病年齡9～68(52.4±11.7) 歲，其中<40歲12例，40～50歲15例，>50～60歲10例，>60歲5例。P-VBDS組43例，其中女35例(81.4%)，男8例(18.6%)，發(fā)病年齡29～72(51.3±12.8) 歲，其中<40歲6例，40～50歲17例，>50～60歲12例，>60歲8例。2組性別構(gòu)成上均是女性多于男性，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);2組發(fā)病年齡比較差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，均以40～50歲年齡段最多見。

2.2BSEP、MRP2、MDR3表達(dá)特點(diǎn)及半定量評(píng)分BSEP、MRP2、MDR3特異性定位于肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜，在對(duì)照組沿肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜側(cè)呈微管狀陽性表達(dá)。D-VBDS組、P-VBDS組中BSEP、MRP2、MDR3在肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜側(cè)陽性表達(dá)均明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)為沿毛細(xì)膽管膜陽性線性表達(dá)較對(duì)照組明顯增粗，有的呈分支狀或小凝塊狀；D-VBDS組、P-VBDS組 BSEP、MRP2、MDR3評(píng)分均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)，但D-VBDS組和P-VBDS組間BSEP、MRP2、MDR3評(píng)分比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見表1。

表1 D-VBDS組、P-VBDS組及對(duì)照組肝組織中 BSEP、MRP2、MDR3免疫組化IOD均值方差分析比較

2.3BSEP、MRP2、MDR3 評(píng)分與不同病理形態(tài)評(píng)分相關(guān)性 D-VBDS組、P-VBDS組中 BSEP、MRP2、MDR3評(píng)分均與小膽管損傷及細(xì)膽管增生呈正相關(guān)性，表現(xiàn)為細(xì)膽管增生越明顯、小膽管損傷越重，BSEP、MRP2、MDR3陽性表達(dá)越強(qiáng)；其他病理形態(tài)特征與BSEP、MRP2、MDR3間均無相關(guān)性(P均>0.05)。見表2。

表2 D-VBDS組與 P-VBDS組BSEP、MRP2、MDR3評(píng)分與不同病理形態(tài)評(píng)分的相關(guān)性

3 討 論

VBDS最早被稱為肝內(nèi)膽管缺乏，是近幾年來逐漸被重視的慢性膽管性疾病，以膽汁淤積、膽管減少為主要特點(diǎn)[3]。實(shí)驗(yàn)室檢查堿性磷酸酶和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶明顯升高，也可出現(xiàn)高直接膽紅素血癥和轉(zhuǎn)氨酶輕度升高。由于該病主要累及終末小膽管，影像學(xué)檢查常無特異性改變，因此肝活檢是診斷膽管損傷、消失和明確病因的重要手段[4]。VBDS的病因可能與發(fā)育異常、代謝和免疫學(xué)異常、感染、藥物等多種因素相關(guān)[5]，其中免疫性和藥物性因素是臨床引起VBDS最主要的兩種病因。因此本研究重點(diǎn)以免疫性PBC引起的VBDS和藥物性引起的VBDS作為觀察分組對(duì)象。既往研究顯示，膽汁由肝細(xì)胞分泌是一個(gè)需要主動(dòng)耗能的排泌過程,行使該功能主要依靠肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜側(cè)上的3種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BSEP、 MRP2和MDR3來共同完成[6-7]，其參與的膽汁排泌是膽汁流形成的關(guān)鍵限速步驟[8]。這3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為ATP結(jié)合盒(ATP binding cassette，ABC)超家族成員，其表達(dá)異常是多種疾病中膽汁淤積的“原發(fā)事件”[9]。研究顯示，BSEP通過ATP的水解將膽鹽逆濃度梯度泵入毛細(xì)膽管,形成毛細(xì)膽管內(nèi)膽汁酸鹽依賴性膽汁流[10]。BSEP基因的表達(dá)異常可引起進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥2型(PFIC2)和良性復(fù)發(fā)性肝內(nèi)膽汁淤積癥2型(BRIC2)[11]。MRP2是唯一將結(jié)合膽紅素從肝細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至毛細(xì)膽管內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[12]，MRP2基因突變或缺失則引起Dubin-Johnson 綜合征。MDR3為卵磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能有效將磷脂從雙分子層膜內(nèi)側(cè)移至外側(cè)膜，與膽鹽和膽固醇形成混合微粒，防止膽鹽對(duì)膽管上皮細(xì)胞的毒性損傷。其表達(dá)水平降低會(huì)使膽汁中卵磷脂含量下降，膽鹽不形成微膠粒，從而降低膽固醇的溶解度[13]，導(dǎo)致膽管上皮細(xì)胞的損傷破壞。3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在急性淤膽性肝病及遺傳代謝性肝病中的表達(dá)特點(diǎn)已有研究報(bào)道，但尚未見到3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在慢性淤膽性肝病，特別是VBDS中的表達(dá)變化。因此本研究觀察了三者在VBDS患者肝組織中表達(dá)及分布特點(diǎn)，分析三者表達(dá)強(qiáng)弱與不同病理形態(tài)之間的關(guān)系，以期探討影響膽汁分泌的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在VBDS的表達(dá)變化特點(diǎn)，并觀察不同的病理形態(tài)改變是否與三者的表達(dá)有相關(guān)性。

首先通過對(duì) D-VBDS組與 P-VBDS組在性別及不同年齡段構(gòu)成比較顯示，2組間年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,2組在性別構(gòu)成上均是女性多于男性，提示不論是PBC引起的VBDS還是藥物性損傷引起的VBDS，均是女性更容易發(fā)生，這是由于女性對(duì)藥物的敏感性高于男性， 同時(shí)PBC也以女性更多見有關(guān)。但2組在不同年齡段例數(shù)比較差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，2組均以中年女性為主，且以40～50年齡段例數(shù)最多見，提示性別及年齡為慢性膽汁淤積的兩大危險(xiǎn)因素。研究認(rèn)為，高齡患者藥物代謝酶細(xì)胞色素P450活性降低、藥物清除率及肝代償功能下降、基礎(chǔ)性疾病等多種因素有關(guān)[14]，從而增加膽管損傷及膽管消失的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，并且更多地進(jìn)展為膽汁淤積性肝損傷[15]。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，雖然D-VBDS組與 P-VBDS組引起VBDS的病因不同，但是2組與正常對(duì)照組比較，3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在肝細(xì)胞膽管膜側(cè)陽性表達(dá)均明顯增強(qiáng)，表明小膽管損傷消失引起肝內(nèi)慢性膽汁淤積，機(jī)體在長(zhǎng)期慢性淤膽的刺激下，促進(jìn)了肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜上的3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過表達(dá)，通過增加轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的合成分泌以期達(dá)到促進(jìn)膽汁排流的目的，從而發(fā)揮代償調(diào)節(jié)作用。該研究結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)當(dāng)長(zhǎng)期慢性膽管損傷消失、膽汁淤積時(shí)，機(jī)體將通過自身調(diào)節(jié)機(jī)制促進(jìn)負(fù)責(zé)膽汁分泌的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，從而起到緩解長(zhǎng)期慢性膽汁淤積的狀態(tài)。同時(shí)，3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在不同病因引起的VBDS肝組織中的表達(dá)變化均較一致， 證明病因不是影響轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的重要因素，不同病因所引起的共同的膽管損傷消失、慢性膽汁淤積的病理形態(tài)學(xué)改變才是造成跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白過表達(dá)的主要因素。同時(shí)通過對(duì)比分析3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)與不同病理形態(tài)之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白組化評(píng)分與細(xì)膽管增生及小膽管損傷呈正相關(guān)性，均表現(xiàn)為細(xì)膽管增生越明顯、小膽管變性損傷越重，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白陽性表達(dá)越強(qiáng)；其他病理形態(tài)特征與3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白間均無相關(guān)性。進(jìn)一步從病理形態(tài)學(xué)角度證實(shí)，細(xì)膽管增生及小膽管變性損傷兩種形態(tài)改變是啟動(dòng)3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白過表達(dá)的病理組織學(xué)基礎(chǔ)，也是反映慢性膽汁淤積的主要病理指標(biāo)，而其他病理學(xué)改變則非重要因素。

本研究顯示，不同病因引起的VBDS可繼發(fā)引起肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜側(cè)BSEP、MDR3、MRP2的過表達(dá)，并從形態(tài)學(xué)上尋找到細(xì)膽管增生及小膽管損傷是與之相關(guān)的病理改變，進(jìn)而為全面認(rèn)識(shí)VBDS提供了更加客觀的研究依據(jù)，對(duì)明確導(dǎo)致慢性膽汁淤積的損傷位點(diǎn)進(jìn)而有針對(duì)性地合理用藥具有重要意義。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。