蘇鵬亮，沈明勤，許尤琪

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028；2. 江蘇省第二中醫(yī)院，江蘇 南京 210008)

肝癌發(fā)病的前期過程較為隱匿，患者一旦被發(fā)現(xiàn)有明顯的臨床癥狀時(shí)往往已步入病程的中晚期，此時(shí)通過手術(shù)切除肝癌病灶所獲得的收益較小，患者面臨的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)較大，因此化療成為中晚期肝癌患者的主要治療選擇。但是長期化療不僅有嚴(yán)重的毒副作用，還會導(dǎo)致耐藥性的形成。近年來，隨著對中醫(yī)學(xué)的不斷挖掘探索，中藥聯(lián)合化療的治療方案顯示出一定的優(yōu)勢。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為原發(fā)性肝癌的主要病因是肝郁脾虛，瘀血內(nèi)阻，治療以疏肝健脾、益氣活血、化瘀解毒為主要治則[1]。江蘇省第二中醫(yī)院腫瘤科根據(jù)中醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論和30多年臨床治療經(jīng)驗(yàn)的積累，研制出了健脾活血方藥，其與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用能夠改善肝癌患者的生活質(zhì)量，降低復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[2]。本實(shí)驗(yàn)通過小鼠肝癌原位瘤模型觀察了健脾活血方聯(lián)合5-氟尿嘧啶(5-Fu)的抑瘤作用并探究其初步的作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1動物與肝癌細(xì)胞 40只Balb/c雌性小鼠，購于江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，飼養(yǎng)于江蘇省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK(蘇)2018-0008。H22小鼠腹水瘤細(xì)胞，購于江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。

1.2藥物、試劑與儀器 健脾活血方，由黃芪、太子參、茯苓、生白術(shù)、山藥、茵陳、薏米仁、莪術(shù)等中藥材配伍而成，每劑方藥的中藥材總量(即臨床上人每日的處方總量)為180 g，所用中藥材均來自相同供應(yīng)商，藥材由江蘇省第二中醫(yī)院藥劑科購入，且均符合2015年版《中國藥典》中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；5-Fu，購自天津金耀氨基酸有限公司(批號：1907241)；注射用青霉素鈉(批號：P20180202)，購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9，批號：ab228402)和基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2，批號：ab86607)的一抗購自ABCAM，上皮型鈣黏附蛋白(E-cadherin，批號：14472s)、α-平滑肌激動蛋白(α-SMA，批號：19245s)以及β-actin(批號：4970s)的一抗購自Cell Signaling Technology，蘇木素-伊紅染液試劑盒(批號： KGA224)購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，DAB Kit(批號：DAB-1031)購自福州邁新生物科技有限公司。電子分析天平(上海梅特勒儀器有限公司，型號：AL104)，吸入式麻醉機(jī)(上海玉研科學(xué)儀器有限公司，型號：ABS-100)，光學(xué)顯微鏡(德國萊卡公司，型號：DMi8)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1H22肝癌細(xì)胞培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[3]對H22肝癌細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、傳代，取傳到第3代且處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行動物造模實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞液離心棄除掉培養(yǎng)基，再用磷酸鹽緩沖液漂洗細(xì)胞2次，然后將細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液重新懸制放在一旁的裝有冰袋的保溫盒中備用。

1.3.2小鼠肝癌原位移植瘤模型的建立 將40只BALB/c小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、5-Fu組、5-Fu聯(lián)合健脾活血方低劑量組、5-Fu聯(lián)合健脾活血方高劑量組，每組8只。將各組Balb/c小鼠麻醉后，先用剃毛機(jī)剔除腹部的毛發(fā)，用碘伏棉簽消毒去毛區(qū)的皮膚，再用手術(shù)刀在小鼠腹部貼近肝部的區(qū)域劃開一約1 cm長的切口，用酒精棉簽將其最大的一塊肝葉輕輕挑出，在肝膜下注入50 μL的H22肝細(xì)胞液(2×107/mL)，輕輕將肝葉放回腹中并向傷口滴加1滴青霉素鈉溶液(8萬IU/mL)預(yù)防感染，最后逐層縫合傷口；假手術(shù)組僅注射磷酸鹽緩沖液，其余步驟均相同。

1.3.3各組小鼠干預(yù)方法 健脾活血方藥液的制備及用藥劑量參考文獻(xiàn)[4-5]，計(jì)算出小鼠灌胃給藥的等效劑量為36.9 g生藥/kg，以等效劑量為低劑量，以2倍等效劑量(73.8 g/kg)為高劑量；5-Fu的用藥劑量和給藥方法參考文獻(xiàn)[6-7]。從造模手術(shù)結(jié)束后第3天開始，5-Fu組隔日給予5-Fu 20 mg/kg腹腔注射1次； 5-Fu聯(lián)合健脾活血方低劑量組、5-Fu聯(lián)合健脾活血方高劑量組5-Fu給藥方案同5-Fu組，同時(shí)每日灌胃相應(yīng)劑量健脾活血方1次；假手術(shù)組和模型組在相同時(shí)間點(diǎn)灌胃等量的蒸餾水。各組均持續(xù)干預(yù)14 d。

1.4觀察指標(biāo)及方法

1.4.1小鼠一般狀態(tài) 實(shí)驗(yàn)過程中觀察各組小鼠的精神行為狀態(tài)、腹部腹部隆起程度等。

1.4.2原位瘤的重量、抑瘤率及腹膜轉(zhuǎn)移率 手術(shù)后第18天處死所有小鼠，剝離肝臟、肝原位瘤，同時(shí)觀察貼近肝臟區(qū)域的腹膜處是否有腫瘤轉(zhuǎn)移灶，如果存在肉眼可見的轉(zhuǎn)移灶也將其剝離下來(計(jì)算腹膜轉(zhuǎn)移率)，稱量肝原位瘤的重量，比較各組原位瘤的重量及抑瘤率，抑瘤率=(模型組的平均瘤重-用藥組的平均瘤重)/模型組的平均瘤重。

1.4.3腫瘤組織及腹膜轉(zhuǎn)移灶的病理形態(tài) 取少許凍存的肝原位瘤和腹膜腫瘤轉(zhuǎn)移灶組織樣本，放置在4%甲醛溶液中固定，經(jīng)脫水、包埋后制成蠟塊，切片后進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)。

1.4.4肝原位瘤組織中α-SMA、MMP-2、MMP-9、E-cadherin表達(dá)免疫印跡法檢測 從-80 ℃低溫冰箱中取出部分腫瘤組織，稱重后加入RIPA裂解液，充分研磨組織，提取總蛋白。蛋白經(jīng)電泳分離后，將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上進(jìn)行封閉操作。加入經(jīng)稀釋的一抗后在4 ℃冰箱中孵育過夜，次日滴加二抗稀釋液進(jìn)行孵育。通過凝膠成像系統(tǒng)發(fā)光顯色，用Image J軟件計(jì)算各蛋白條帶的灰度值。

1.4.5肝原位瘤組織中α-SMA、E-cadherin表達(dá)免疫組化染色法檢測 將肝原位瘤的組織蠟塊進(jìn)行脫水、切片、固定等處理后，對得到的切片進(jìn)行封閉操作，滴入50 μL即用型山羊血清，加入一抗稀釋液進(jìn)行孵育，加入50 μL MaxVision TM聚合物后滴加二抗稀釋液進(jìn)行孵育，進(jìn)行DAB顯色，置入光鏡下任選一片視野攝取照片，借助Image J分析軟件推算出各目標(biāo)蛋白陽性表達(dá)面積占整張圖片面積的比例為蛋白陽性表達(dá)率。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠一般狀態(tài) 各組小鼠至實(shí)驗(yàn)結(jié)束均無死亡。假手術(shù)組小鼠實(shí)驗(yàn)全程的精神狀態(tài)、飲水飲食均正常，身體表面無異?，F(xiàn)象發(fā)生。造模后第10天開始，模型組小鼠出現(xiàn)較為明顯的腹水現(xiàn)象，越往后期其腹部隆起程度越大，行動變得更加遲緩，多喜歡趴在飼養(yǎng)箱中某一位置不動，生命垂危。5-Fu組出現(xiàn)腹水的小鼠少于模型組，但精神狀態(tài)比較萎靡，活動減少。與5-Fu組比較，5-Fu聯(lián)合健脾活血方低劑量組、5-Fu聯(lián)合健脾活血方高劑量組發(fā)生腹水現(xiàn)象的小鼠少且腹部隆起程度小，活動變多，精神狀態(tài)有所改善。

2.2各組小鼠肝原位瘤重量、抑瘤率及腹膜轉(zhuǎn)移率比較 假手術(shù)組小鼠肝臟表面無疑似瘤塊，其余臟器也無異常。5-Fu組、5-Fu聯(lián)合健脾活血方低劑量組、5-Fu聯(lián)合健脾活血方高劑量組小鼠的肝原位瘤重均顯著輕于模型組(P均<0.05)，腹膜轉(zhuǎn)移率均明顯低于模型組(P均<0.05)；5-Fu聯(lián)合健脾活血方低劑量組、5-Fu聯(lián)合健脾活血方高劑量組的肝原位瘤重明顯輕于5-Fu組(P均<0.05)，抑瘤率明顯高于5-Fu組(P均<0.05)，腹膜轉(zhuǎn)移率均明顯低于5-Fu組(P均<0.05)。見表1。

調(diào)查信息化強(qiáng)調(diào)的是調(diào)查手段及其過程的信息引導(dǎo)和應(yīng)用，“信息引導(dǎo)職務(wù)犯罪調(diào)查機(jī)制是我國檢察機(jī)關(guān)在信息化時(shí)代背景下職務(wù)犯罪調(diào)查工作的必然選擇”。［2］信息化調(diào)查促進(jìn)了傳統(tǒng)調(diào)查方式的革新，拓寬了調(diào)查工作視野。需要強(qiáng)調(diào)的是，職務(wù)犯罪調(diào)查因其調(diào)查對象、犯罪活動和調(diào)查過程的特殊性，在調(diào)查線索來源、調(diào)查途徑選擇等方面與普通刑事案件偵查有較大的差別。因此，公安機(jī)關(guān)信息化調(diào)查的一般模式難以普遍適應(yīng)職務(wù)犯罪調(diào)查。職務(wù)犯罪調(diào)查過程中，對犯罪信息的需要具有如下特征：

表1 各組小鼠肝原位瘤重、抑瘤率及腹膜轉(zhuǎn)移率比較

2.3各組小鼠肝原位瘤及腹膜轉(zhuǎn)移灶的病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 模型組小鼠肝原位瘤組織中的癌細(xì)胞分布緊密，壞死程度較小；5-Fu組中出現(xiàn)小片壞死的癌細(xì)胞，其壞死程度多于模型組；5-Fu聯(lián)合健脾活血方低劑量組與5-Fu聯(lián)合健脾活血方高劑量組中均出現(xiàn)大片染紅并發(fā)生壞死破裂的癌細(xì)胞，壞死程度均多于5-Fu組，見圖1。各組腹膜組織觀察，模型組中有大片腫瘤細(xì)胞侵入腹膜中，5-Fu組腹膜中的腫瘤細(xì)胞侵入程度相較模型組輕，5-Fu聯(lián)合健脾活血方低劑量組與5-Fu聯(lián)合健脾活血方高劑量組腹膜中的腫瘤細(xì)胞侵入程度較5-Fu組輕，見圖2。

圖1 各組小鼠肝原位瘤組織HE染色表現(xiàn)(×200)

圖2 各組小鼠肝原位瘤腹膜轉(zhuǎn)移灶HE染色表現(xiàn)(×200)

2.4各組小鼠肝原位瘤組織中相關(guān)蛋白免疫印跡檢測情況 與模型組比較，5-Fu組、5-Fu聯(lián)合健脾活血方低劑量組、5-Fu聯(lián)合健脾活血方高劑量組的α-SMA表達(dá)量及5-Fu聯(lián)合健脾活血方低劑量組、5-Fu聯(lián)合健脾活血方高劑量組的MMP-2、MMP-9表達(dá)量均顯著下調(diào)(P均<0.05)，5-Fu組、5-Fu聯(lián)合健脾活血方低劑量組、5-Fu聯(lián)合健脾活血方高劑量組的E-cadherin表達(dá)量均顯著上調(diào)(P均<0.05)；5-Fu聯(lián)合健脾活血方低劑量組、5-Fu聯(lián)合健脾活血方高劑量組的α-SMA、MMP-2、MMP-9表達(dá)量均顯著低于5-Fu組(P均<0.05)，E-cadherin表達(dá)量均顯著高于5-Fu組(P均<0.05)，5-Fu聯(lián)合健脾活血方低劑量組各指標(biāo)與5-Fu聯(lián)合健脾活血方高劑量組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。 見圖3。

圖3 蛋白免疫印跡法檢測各組小鼠肝原位瘤組織中相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2.5各組小鼠肝原位瘤組織中相關(guān)蛋白免疫組化檢測情況 與模型組比較，5-Fu組、5-Fu聯(lián)合健脾活血方低劑量組、5-Fu聯(lián)合健脾活血方高劑量組的α-SMA陽性表達(dá)率均顯著下降(P均<0.05)，E-cadherin陽性表達(dá)率均顯著升高(P均<0.05)；5-Fu聯(lián)合健脾活血方低劑量組、5-Fu聯(lián)合健脾活血方高劑量組的α-SMA陽性表達(dá)率均顯著低于5-Fu組(P均<0.05)，E-cadherin陽性表達(dá)率均顯著高于5-Fu組(P均<0.05)，5-Fu聯(lián)合健脾活血方低劑量組各指標(biāo)與5-Fu聯(lián)合健脾活血方高劑量組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖4。

圖4 免疫組化法檢測各組肝原位瘤中相關(guān)蛋白的表達(dá)情況(×100)

3 討 論

肝癌一旦進(jìn)展到中晚期，腫瘤細(xì)胞會擴(kuò)散轉(zhuǎn)移至患者的多個(gè)臟器，引起多臟器功能衰竭而導(dǎo)致患者死亡。目前肝癌的治療方法有限，近年來以中藥作為輔助療法的治療方案顯示出一定優(yōu)勢[8]。董孟佳[4]研究報(bào)道，肝動脈栓塞化療術(shù)聯(lián)合健脾活血方口服治療可明顯改善原發(fā)性肝癌患者的生活質(zhì)量，減輕肝動脈栓塞化療的毒副作用；且健脾活血方能通過抑制血管生成和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制肝癌SMMC-7721裸鼠移植瘤模型的腫瘤生長。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程是腫瘤增殖生長過程中異?；钴S的生理活動，肝癌細(xì)胞同樣具有較強(qiáng)的將上表表型細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)表型細(xì)胞的能力，其依靠這種能力將自身的遷移侵襲活力增強(qiáng)，從而通過血液移動到其他器官，加重了腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[15]。E-cadherin是依賴于Ca2+存在且位于上皮樣表型細(xì)胞膜表面的跨膜蛋白，其表達(dá)量升高有助于穩(wěn)定細(xì)胞的上皮樣表型并阻礙細(xì)胞向間質(zhì)樣表型轉(zhuǎn)化，從而延緩上皮間質(zhì)化進(jìn)程[16]。α-SMA是一種平滑肌激動蛋白，其同時(shí)也是腫瘤細(xì)胞間質(zhì)中的重要組分，是細(xì)胞間質(zhì)化活動異常增強(qiáng)的標(biāo)志性蛋白，腫瘤細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)上調(diào)會加速上皮間質(zhì)化的過程。腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)化的過程中，相鄰細(xì)胞之間的黏附能力降低，基底膜被破壞，而在此過程中基質(zhì)金屬蛋白酶如MMP-2與MMP-9反常上調(diào)表達(dá)，其可以加快基底膜的分解速度，從而推進(jìn)上皮間質(zhì)化過程。既往相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，單純使用5-Fu可以下調(diào)α-SMA、MMP-2與MMP-9的表達(dá)以及上調(diào)E-cadherin的表達(dá)[17-19]，本實(shí)驗(yàn)研究也同樣發(fā)現(xiàn)5-Fu有上述作用。本實(shí)驗(yàn)還顯示，5-Fu聯(lián)合健脾活血方低劑量組、5-Fu聯(lián)合健脾活血方高劑量組的α-SMA、MMP-2、MMP-9表達(dá)量均顯著低于5-Fu組，E-cadherin表達(dá)量均顯著高于5-Fu組。提示健脾活血方可以協(xié)同5-Fu調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)化過程中相關(guān)蛋白α-SMA、MMP-2、MMP-9與E-cadherin的表達(dá)，這可能是健脾活血方配合5-Fu發(fā)揮藥效的潛在藥理學(xué)機(jī)制。

綜上所述，健脾活血方聯(lián)合5-Fu可明顯抑制小鼠肝癌原位移植瘤的生長，其作用機(jī)制可能與下調(diào)α-SMA、MMP-2、MMP-9的表達(dá)及上調(diào)E-cadherin的表達(dá)相關(guān)。但是上皮間質(zhì)化過程由多個(gè)蛋白及多個(gè)信號通路參與，還需對上皮間質(zhì)化的其他蛋白信號通路進(jìn)行更為深入的藥理機(jī)制與分子生物學(xué)機(jī)制研究，且運(yùn)用中西醫(yī)結(jié)合方法治療惡性腫瘤的優(yōu)勢和確切的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。