王德好，王文儒，諶海燕，郭 明，郎海燕，李 玲，丁曉慶，劉軍霞

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2. 中國中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700；3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078)

再生障礙性貧血是一種以骨髓造血功能衰竭為特點(diǎn)的疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，近年來免疫失衡(Th17細(xì)胞、 Treg細(xì)胞的變化及二者比例失衡)與該病的關(guān)系逐漸引起國內(nèi)外學(xué)者的重視[1-2]。脾臟作為髓外機(jī)體重要的免疫器官之一，其形態(tài)和功能變化與再生障礙性貧血的關(guān)系值得學(xué)者們探索。再障膏方是北京中醫(yī)院大學(xué)東方醫(yī)院蘇偉教授的經(jīng)驗(yàn)方，可改善再生障礙性貧血患者的癥狀，但其作用機(jī)制不明。本實(shí)驗(yàn)基于再生障礙性貧血模型小鼠，探討了再障膏方是否可通過調(diào)控Treg/Th17細(xì)胞失衡來調(diào)節(jié)再生障礙性貧血的免疫異常狀態(tài)，并觀察了其對脾臟形態(tài)和功能的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 選取北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部提供的近交系BALB/c雌性小鼠56只，SPF級，8～12周齡，體重18～22 g，動物合格證號：SCXK(京)2016-0010。小鼠分籠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)室，自由飲食，保持環(huán)境清潔，控制溫度20～25 ℃、相對濕度50%～70%，隔天更換墊料，定期消毒鼠籠。

1.2藥物、試劑及儀器 白消安，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；環(huán)孢素軟膠囊，杭州中美華東制藥有限公司；再障膏方，由當(dāng)歸、熟地黃、黨參、續(xù)斷、炙黃芪、陳皮、女貞子、白術(shù)、川芎、杜仲、茯苓、白芍、丹參、枸杞子、何首烏、鹿角膠、菟絲子、墨旱蓮、龜板膠、肉蓯蓉、桑寄生等組成，北京中醫(yī)院大學(xué)東方醫(yī)院制劑室統(tǒng)一濃煎呈膏狀，并由藥劑室進(jìn)行藥材質(zhì)量控制。溶血素、CD3單克隆抗體(PE-Cy5標(biāo)記)、CD4單克隆抗體(FITC標(biāo)記)、CD25單克隆抗體(PE標(biāo)記)、Foxp3抗體(APC標(biāo)記)、RORγt抗體(BV421標(biāo)記)、FcR阻斷劑(CD16/32)、Foxp3染色緩沖組等。高端分析流式細(xì)胞儀、全自動血液分析儀、光學(xué)顯微鏡等。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 將小鼠隨機(jī)分為空白組8只、模型組18只、中西醫(yī)結(jié)合組10只、再障膏方組10只、環(huán)孢素組10只?？瞻捉M灌胃無菌注射液；其余組均灌胃白消安片經(jīng)研磨后制成的懸液(4 mg/mL)建立再生障礙性貧血模型，36 mg/(kg·d)，連續(xù)灌胃5 d。自實(shí)驗(yàn)第11天開始，模型組與空白組灌胃無菌注射用水0.1 mL，早晚各1次；再障膏方組早上灌胃820 mg/mL再障膏方溶液0.1 mL，晚上灌胃無菌注射用水0.1 mL；環(huán)孢素組早上灌胃無菌注射用水0.1 mL，晚上灌胃5 mg/mL 環(huán)孢素溶液0.1 mL；中西醫(yī)結(jié)合組早上灌胃820 mg/mL再障膏方溶液0.1 mL，晚上灌胃5 mg/mL 環(huán)孢素溶液0.1 mL。各組均連續(xù)干預(yù)10 d。

1.4觀察指標(biāo)及方法

1.4.1一般情況 每天觀察各組小鼠精神體態(tài)(口周唇瓣、耳朵爪甲、毛發(fā)鼠尾等)、飲食二便、行為活動等，隔天稱重并記錄，密切注意小鼠有無出血及感染情況并記錄。

1.4.2外周血象 于實(shí)驗(yàn)第21天，各組小鼠摘眼球取外周血，放入EDTA抗凝管中，輕搖，全自動血液分析儀檢測血小板計(jì)數(shù)(Plt)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、血紅蛋白(Hb)水平。

1.4.3外周血Treg、Th17細(xì)胞檢測 取外周血200 μL,用肝素抗凝,加入CD3 、CD4、CD25單抗和Foxp3抗體和RORγt抗體標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀在4 h內(nèi)檢測。

1.4.4體重、脾臟指數(shù)與脾臟組織形態(tài)學(xué) 記錄各組小鼠實(shí)驗(yàn)開始、實(shí)驗(yàn)第11天和實(shí)驗(yàn)第21天體重。實(shí)驗(yàn)第21天小鼠摘眼球取血后頸椎脫臼處死，取脾臟并稱重，計(jì)算脾臟指數(shù)(脾重/體重)。然后將脾臟置入多聚甲醛中固定，取中間部分修塊(厚度以3 mm為宜)后脫水，石蠟包埋固定，冷卻后切片，行脫蠟及HE染色，鏡下觀察脾臟組織形態(tài)。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠一般狀況及存活情況 空白組小鼠耳朵腳爪及口周唇瓣顏色紅潤，毛發(fā)整齊有光澤，飲食飲水正常，二便無異常，反應(yīng)靈活，體重逐步增加，無死亡。其他組小鼠造模及觀察期間開始表現(xiàn)出急躁不安，后來逐漸出現(xiàn)精神欠佳，弓背扎堆現(xiàn)象，唇瓣灰白，爪甲及耳郭蒼白，毛發(fā)變暗散亂，部分出現(xiàn)口鼻滲血、便血或尾部皮膚出血現(xiàn)象，治療開始時未有小鼠死亡。模型組于實(shí)驗(yàn)第15天起之后每天陸續(xù)死亡1～3只，第21天剩余9只，存活率為50%；其余3組小鼠給予藥物干預(yù)后出血情況有所好轉(zhuǎn)，多數(shù)精神活動及飲食較之前明顯恢復(fù)，大便成形，中西醫(yī)結(jié)合組和環(huán)孢素組在治療后期各死亡3只，存活率均為70%。再障膏方組分別于治療前期和后期死亡1只和3只，存活率為60%。

2.2各組小鼠外周血象比較 空白組和模型組各有1份樣本不合格剔除。模型組外周血中WBC、RBC、Hb、Plt均明顯低于空白組(P均<0.05)； 中西醫(yī)結(jié)合組WBC、RBC、Hb、Plt和再障膏方組Plt及環(huán)孢素組RBC、Plt均明顯高于模型組(P均<0.05)；中西醫(yī)結(jié)合組Plt明顯高于環(huán)孢素組(P<0.05)，WBC、RBC、Hb與環(huán)孢素組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；中西醫(yī)結(jié)合組WBC、Plt均明顯高于再障膏方組(P均<0.05)，RBC、Hb與再障膏方組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 空白組和再生障礙性貧血各組小鼠外周血象比較

2.3各組小鼠外周血中Th17與Treg細(xì)胞占比及Treg/Th17比較 模型組有3份標(biāo)本不合格剔除。模型組外周血中Treg細(xì)胞占比及Treg/Th17均明顯低于空白組(P均<0.05)，Th17細(xì)胞占比明顯高于空白組(P<0.05)；中西醫(yī)結(jié)合組Treg細(xì)胞占比及Treg/Th17均明顯高于模型組(P均<0.05)；再障膏方組、環(huán)孢素組各指標(biāo)與模型組、中西醫(yī)結(jié)合組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，再障膏方組與環(huán)孢素組各指標(biāo)比較差異也均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 空白組和再生障礙性貧血各組小鼠外周血Th17、Treg細(xì)胞占比及Treg/Th17比較

2.4各組小鼠體重及脾臟指數(shù)比較 實(shí)驗(yàn)第11天和實(shí)驗(yàn)第21天，模型組、中西醫(yī)結(jié)合組、再障膏方組、環(huán)孢素組小鼠體重均明顯低于空白組(P均<0.05)，中西醫(yī)結(jié)合組、再障膏方組、環(huán)孢素組小鼠體重比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；模型組小鼠脾臟指數(shù)明顯低于空白組(P<0.05)，中西醫(yī)結(jié)合組、環(huán)孢素組脾臟指數(shù)明顯高于模型組和再障膏方組(P均<0.05)，中西醫(yī)結(jié)合組與環(huán)孢素組比較、再障膏方組與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

表3 空白組和再生障礙性貧血各組小鼠體重與脾臟指數(shù)比較

2.5各組小鼠HE染色脾臟形態(tài)比較 各組小鼠脾臟脫水后脾臟形態(tài)結(jié)構(gòu)基本可判斷，包膜完整?？瞻捉M小鼠生發(fā)中心可見，脾臟紅白髓界限較清楚；模型組小鼠生發(fā)中心不可見，且紅白髓界限消失；中西醫(yī)結(jié)合組出現(xiàn)散在的生發(fā)中心，紅白髓界基本可見；再障膏方組紅白髓界限模糊，難以識別；環(huán)孢素組紅白髓界限隱約可見。見圖1。

圖1 空白組和再生障礙性貧血各組小鼠脾臟形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(HE染色，×200)

3 討 論

2017年版中國《再生障礙性貧血診斷治療專家共識》[3]提到，環(huán)孢素治療再生障礙性貧血時用量減少過快會導(dǎo)致復(fù)發(fā)風(fēng)險增高，其推薦環(huán)孢素服用1年以上至癥狀完全緩解。但環(huán)孢素有明顯毒副作用，即使是標(biāo)準(zhǔn)劑量也有部分再生障礙性貧血患者會出現(xiàn)腎功能異常甚至早期死亡[4-5]，且完全緩解后再經(jīng)過后續(xù)的長期治療會出現(xiàn)克隆進(jìn)化風(fēng)險[6]。故尋求有效替代方案或聯(lián)合治療減輕環(huán)孢素的毒副作用是臨床探討的熱點(diǎn)問題。

中醫(yī)藥治療再生障礙性貧血的研究歷史悠久，1999年周靄祥等[7]動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，益腎生血片可促進(jìn)白消安誘導(dǎo)的再生障礙性貧血小鼠骨髓造血干細(xì)胞增殖，提高機(jī)體非特異性免疫力、抗感染力和抵抗力。2005年蘇偉等[8]研究報道，益氣養(yǎng)血補(bǔ)腎法聯(lián)合康力龍治療重型再生障礙性貧血總有效率達(dá)88.24%，治療6個月后外周血紅蛋白明顯升高，其中巨核系改善較慢，紅、粒系改善較快。鐘永根等[9]和李峻等[10]研究也證實(shí)中西醫(yī)聯(lián)合用藥治療再生障礙性貧血具有較大優(yōu)勢 。丁曉慶等[11]認(rèn)為氣虛、血虛、腎虛是再生障礙性貧血的基本證候。再障膏方以八珍湯為基礎(chǔ)益氣養(yǎng)血，重用黃芪，以益氣生血、補(bǔ)氣攝血；桑寄生、何首烏、肉蓯蓉、續(xù)斷、杜仲補(bǔ)腎填精；加鹿角膠、龜板膠，取龜鹿二仙膠峻補(bǔ)精髓之力；墨旱蓮、女貞子滋補(bǔ)肝腎，與二膠成“陰陽雙補(bǔ)”之勢同時又可循“乙癸同源”。再生障礙性貧血病程較長，患者長期服藥，補(bǔ)藥多滋膩，妨礙運(yùn)化，故適當(dāng)輔以理氣化濕之品。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，再障膏方對再生障礙性貧血外周血象的影響與環(huán)孢素相似，再障膏方與環(huán)孢素合用促進(jìn)外周血象恢復(fù)的效果優(yōu)于各自單用。

Treg細(xì)胞可分為CD4+和CD8+兩大類，主要存在于外周血和脾臟中[12]。Treg細(xì)胞既可以促進(jìn)免疫抑制性因子分泌，也可抑制T細(xì)胞增殖和活化，負(fù)性調(diào)控自身反應(yīng)性T細(xì)胞[13]。Th17細(xì)胞屬于CD4+T細(xì)胞，其主要分泌白細(xì)胞介素-17(IL-17)，并與多種細(xì)胞因子相關(guān)構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[14]。炎癥細(xì)胞尤其是中性粒細(xì)胞，可被IL-17募集，引起組織破壞與細(xì)胞浸潤， 導(dǎo)致造血干細(xì)胞衰竭，從而損害機(jī)體造血功能[15]。Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞功能截然相反，相互拮抗，二者比值保持動態(tài)平衡可維持機(jī)體免疫狀態(tài)穩(wěn)定，而再生障礙性貧血患者存在Th17/Treg細(xì)胞失衡，外周血中Th17細(xì)胞相關(guān)因子異常增多[16-18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組外周血中Treg細(xì)胞占比及Treg/Th17均明顯低于空白組，Th17細(xì)胞占比明顯高于空白組；中西醫(yī)結(jié)合組Treg細(xì)胞占比及Treg/Th17均明顯高于模型組，再障膏方組、環(huán)孢素組各指標(biāo)變化不明顯。提示再障膏方聯(lián)合環(huán)孢素可促使再生障礙性貧血小鼠免疫異常狀態(tài)恢復(fù)，但再障膏方和環(huán)孢素單獨(dú)應(yīng)用作用不明顯，單用再障膏方作用不明顯考慮是用藥時間過短導(dǎo)致。

脾臟是人體重要的免疫器官，脾臟指數(shù)可間接反映機(jī)體免疫狀態(tài)[19]，而脾臟形態(tài)結(jié)構(gòu)是機(jī)體免疫狀態(tài)的客觀體現(xiàn)，其中白髓的主要構(gòu)成要素為脾臟內(nèi)的淋巴細(xì)胞與血管部分的淋巴鞘，若機(jī)體的免疫功能發(fā)生紊亂，則紅白髓交界模糊，難見生發(fā)中心[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，再生障礙性貧血小鼠脾臟指數(shù)明顯降低，脾臟形態(tài)異常，紅白髓界限及生發(fā)中心消失，提示脾臟功能受損，免疫功能紊亂；各給藥組小鼠脾臟指數(shù)均較模型組升高，脾臟形態(tài)有所恢復(fù)，提示機(jī)體免疫功能改善，其中再障膏方與環(huán)孢素聯(lián)合應(yīng)用效果更好。

綜上所述， 環(huán)孢素與再障膏方合用較二者單用能更好地促進(jìn)再生障礙性貧血小鼠血象恢復(fù)，能更明顯改善Treg/Th17細(xì)胞比值異常及脾臟功能。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。