許藝飛，余 峰，楊炯明1，，歐奕君，杜 思，陳芳軍，黃 萍

(1.深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518000；2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州510006)

男性性功能問(wèn)題一直是社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題之一。陰莖勃起依賴神經(jīng)和血管的相互作用，其過(guò)程為在性刺激下，機(jī)體釋放一氧化氮(NO)激活鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，使胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷濃度提高，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣濃度下降而舒張血管平滑肌，最終引起海綿體內(nèi)小動(dòng)脈擴(kuò)張及靜脈閉塞而使陰莖充血勃起[1]。常見(jiàn)動(dòng)脈供血不足的疾病如高血壓、血脂異常、糖尿病及靜脈閉塞功能障礙都容易引發(fā)勃起功能問(wèn)題[2-3]，藥物不良反應(yīng)、衰老及不良的生活習(xí)慣也是不可回避的因素。目前臨床上改善勃起功能的方法多種多樣，如口服藥物、注射用藥、植入假體、體外沖擊波治療、干細(xì)胞治療等[1]，其中口服藥物磷酸二酯酶5型抑制劑如西地那非雖有效，但存在治療的長(zhǎng)期安全性及藥物相互作用等諸多問(wèn)題[4]，其他方法也存在療效有限、安全性等各種弊端，有待尋找新的治療方法。廣藿香(Pogostemon cablin(Blanco) Benth.)是十大“南藥”之一，廣藿香及其有效成分具有松弛多種平滑肌的作用，廣藿香油具有緩解抑郁、鎮(zhèn)定、控制食欲和提高性興趣作用[5]。廣藿香揮發(fā)油提取物中的廣藿香醇是一種三環(huán)倍半萜，其可能通過(guò)降低胞內(nèi)鈣離子濃度而起到強(qiáng)烈舒張血管作用[6-7]，而血管舒張是誘發(fā)陰莖充血勃起的關(guān)鍵因素之一[8]。前期研究中發(fā)現(xiàn)，廣藿香醇可通過(guò)促進(jìn)陰莖海綿體平滑肌中神經(jīng)型NO的釋放，表現(xiàn)出舒張陰莖海綿體平滑肌的潛力[9]。同時(shí)，廣藿香醇在體給藥后，在酸性胃液條件下會(huì)代謝為β-廣藿香烯[10]。故本實(shí)驗(yàn)探討了廣藿香醇及β-廣藿香烯對(duì)雄性動(dòng)物的勃起功能和β-廣藿香烯對(duì)海綿體平滑肌舒張功能的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1藥物及試劑 廣藿香醇及β-廣藿香烯，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)蘇子仁教授提供，質(zhì)控鑒定兩單體的氣相色譜-質(zhì)譜>98%；鹽酸阿撲嗎啡(APO，湖北科益藥業(yè)股份有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)及抗壞血酸(Sigma-Aldrich公司)；苯甲酸雌二醇注射液(天津金耀藥業(yè)有限公司)；黃體酮注射液(河南科倫藥業(yè)有限公司)；去氧腎上腺素(Target Molecule)；Tween-80(吐溫-80，瑞舒生物科技有限公司)；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠。

1.2儀器 LE13206 型八腔離體器官灌流系統(tǒng)(美國(guó) Harvard Apparatus 公司)；LE13206恒溫加熱器(西班牙Panlab公司)；BR4740-ISO510A 型橋式放大器(美國(guó) Harvard Apparatus 公司)；PL3508型張力換能器(澳大利亞AD Instruments 公司)；Powerlab 生理記錄儀(澳大利亞 AD Instruments 公司)；ME204E型電子天平(瑞士METTLER TOLEDO 公司)；各種量程可調(diào)型的微量移液器(德國(guó)Eppendorf公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)KM小鼠，雄性120只及雌性60只，體重24～28 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(粵)2013-0034。SPF級(jí)成年雄性SD大鼠56只，體重260～280 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(粵)2018-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)在20～ 24 ℃且黑白12 h光照規(guī)律環(huán)境下，并自由飲食。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1廣藿香醇對(duì)去勢(shì)雄性小鼠臟器系數(shù)影響實(shí)驗(yàn) 取60只雄性小鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、去勢(shì)組、廣藿香醇高劑量組、廣藿香醇中劑量組、廣藿香醇低劑量組，每組12只。術(shù)前14 d開(kāi)始，廣藿香醇高、中、低劑量組分別給予40 mg/kg、20 mg/kg、10 mg/kg 廣藿香醇液(用泊洛沙姆407配制，劑量設(shè)置參考文獻(xiàn)[11])灌胃，假手術(shù)組和去勢(shì)組給予泊洛沙姆407水溶液灌胃，均1次/d。灌胃14 d后，各組同時(shí)在10%水合氯醛麻醉下進(jìn)行手術(shù)，將小鼠仰臥置于硅板上，用碘酒和酒精先后消毒睪丸皮膚，無(wú)菌下剪開(kāi)皮膚長(zhǎng)約0.5 cm，分離皮下組織，將睪丸拉出，連同附睪一并在近心端結(jié)扎，摘除雙側(cè)睪丸及附睪(假手術(shù)組不摘除)，縫合切口。術(shù)后第3 天開(kāi)始，各組繼續(xù)按術(shù)前方案灌胃7 d。末次灌胃后1 h空腹稱重，脫頸椎處死，小心分離小鼠前列腺精囊腺、包皮腺，立即用分析電子天平稱重，記錄臟器重量，計(jì)算臟器系數(shù)[臟器重量(mg)/體重(g)]。

1.4.2廣藿香醇對(duì)小鼠性行為影響實(shí)驗(yàn) 取60只雄性小鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、鹽酸阿撲嗎啡組、廣藿香醇高劑量組、廣藿香醇中劑量組、廣藿香醇低劑量組，每組12只?？瞻讓?duì)照組給予泊洛沙姆407水溶液灌胃，廣藿香醇高、中、低劑量組分別給予40 mg/kg、20 mg/kg、10 mg/kg 廣藿香醇液灌胃，均1次/d，灌胃7 d后進(jìn)行交配行為測(cè)試；鹽酸阿撲嗎啡組小鼠在測(cè)試前20 min皮下注射10 μg/kg鹽酸阿撲嗎啡(溶于0.5%的維生素C生理鹽水中)。分別在交配實(shí)驗(yàn)前48 h和4 h給予皮下注射苯甲酸雌二醇(20 μg/kg)和黃體酮注射液(500 μg/kg)來(lái)誘導(dǎo)雌鼠發(fā)情。交配行為測(cè)試參考文獻(xiàn)[12-13]進(jìn)行，時(shí)間安排在19:00—23:00，保持室內(nèi)安靜，用昏暗的紅燈照明。先將雄鼠投入籠中，待雄鼠適應(yīng)5 min后，各放入1只雌鼠，觀察各組小鼠在20 min內(nèi)交配行為，記錄騎跨潛伏期(自雌鼠投入至雄鼠第1次撲捉雌鼠的時(shí)間)、騎跨小鼠只數(shù)(雄鼠撲捉雌鼠或者爬背的動(dòng)作次數(shù))及射精小鼠只數(shù)，結(jié)果由3人同時(shí)觀察并記錄，取其平均值。

1.4.3廣藿香醇對(duì)大鼠陰莖勃起反射影響實(shí)驗(yàn)取40只雄性SD大鼠,隨機(jī)分成空白對(duì)照組、鹽酸阿撲嗎啡組、廣藿香醇高劑量組、廣藿香醇中劑量組、廣藿香醇低劑量組，每組8只?？瞻讓?duì)照組給予泊洛沙姆407水溶液灌胃，廣藿香醇高、中、低劑量組分別給予40 mg/kg、20 mg/kg、10 mg/kg 廣藿香醇液灌胃，均1次/d。第7天灌胃40 min后，將大鼠放入玻璃缸中；鹽酸阿撲嗎啡組大鼠在投入玻璃缸前皮下注射150 μg/kg鹽酸阿撲嗎啡。用DV拍攝記錄50 min內(nèi)各組大鼠勃起情況(以大鼠陰莖體增長(zhǎng)、露出作為勃起標(biāo)志)，記錄勃起次數(shù)、舔陰莖次數(shù)、每次勃起時(shí)間、勃起陽(yáng)性率，結(jié)果由3人同時(shí)觀察并記錄，取其平均值。

1.4.4β-廣藿香烯對(duì)大鼠勃起反射影響實(shí)驗(yàn)選取雄性SD大鼠16只，隨機(jī)分為對(duì)照組及β-廣藿香烯組，每組8只。β-廣藿香烯組給予β-廣藿香烯(β-廣藿香烯與Tween-80 1∶1混合，加適量蒸餾水配成4 mg/L)20 mg/(kg·d)灌胃，對(duì)照組灌胃等體積的蒸餾水(含0.1% Tween-80)，均1次/d，連續(xù)7 d。末次灌胃30 min后，參考文獻(xiàn)[14]進(jìn)行大鼠陰莖勃起反射實(shí)驗(yàn)：將大鼠置于玻璃實(shí)驗(yàn)裝置中，保持環(huán)境安靜和光線暗淡，用攝像機(jī)拍攝50 min，記錄大鼠的勃起潛伏期(從放入大鼠開(kāi)始拍攝到大鼠第1次勃起的時(shí)間)、勃起次數(shù)(50 min內(nèi)大鼠的總勃起次數(shù))、勃起時(shí)間(大鼠平均每次勃起的時(shí)間)，結(jié)果由3人同時(shí)觀察并記錄，取其平均值。

1.4.5大鼠陰莖海綿體張力實(shí)驗(yàn) 將“1.4.4”中2組大鼠脫頸椎處死，將其陰莖沿著恥骨取出并放入含冰冷的Kreb’s緩沖液(NaCl 120 mmol/L，KCl 5.9 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，NaH2PO41.2 mmol/L，MgCl21.2 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L和右旋葡萄糖11.5 mmol/L)培養(yǎng)皿中(4 ℃)，并持續(xù)通入含95%氧氣和5%二氧化碳的混合氣。將筋膜、尿道和白膜去除，沿中間將海綿體分成2條。將陰莖海綿體平滑肌條的每一端用絲線捆扎，轉(zhuǎn)移到含有Kreb’s溶液的5 mL(37 ℃)器官浴槽中，浴槽中持續(xù)通入含95%氧氣和5%二氧化碳的混合氣。將陰莖海綿體平滑肌條的一端連接到固定鉤子，另一端連接到力傳感器以測(cè)量平滑肌條張力[15]。將海綿體平滑肌條在500 mg張力下平衡60 min，采用Powerlab記錄采集張力數(shù)據(jù)，然后用10 μmol/L去氧腎上腺素預(yù)收縮海綿體平滑肌條，收縮達(dá)到坪值后, β-廣藿香烯組依次累積加入10-6～10-4mol/L β-廣藿香烯，對(duì)照組加入等量的DMSO，測(cè)定β-廣藿香烯的量效曲線。

2 結(jié) 果

2.1廣藿香醇對(duì)去勢(shì)雄性小鼠前列腺+精囊系數(shù)和包皮腺系數(shù)影響 去勢(shì)組小鼠的前列腺+精囊系數(shù)及包皮腺系數(shù)均顯著低于假手術(shù)組(P均<0.05)；廣藿香醇各組小鼠的前列腺+精囊系數(shù)及包皮腺系數(shù)與去勢(shì)組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；各組小鼠體重下降比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 假手術(shù)組和去勢(shì)各組雄性小鼠前列腺+精囊系數(shù)和包皮腺系數(shù)比較

2.2廣藿香醇對(duì)雄性小鼠性行為影響 廣藿香醇各組雄性小鼠的騎跨潛伏期及騎跨、射精只數(shù)與空白對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組雄性小鼠性行為情況比較

2.3廣藿香醇對(duì)雄性大鼠陰莖反射的影響 與空白對(duì)照組比較，鹽酸阿撲嗎啡組和廣藿香醇中劑量組大鼠勃起次數(shù)均顯著增加(P均<0.05),鹽酸阿撲嗎啡組和廣藿香醇各組大鼠每次勃起時(shí)間均顯著延長(zhǎng)(P均<0.05)，鹽酸阿撲嗎啡組和廣藿香醇中、低劑量組大鼠勃起陽(yáng)性率均顯著增高(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組雄性大鼠勃起情況比較

2.4β-廣藿香烯對(duì)雄性大鼠勃起反射的影響 β-廣藿香烯組大鼠勃起潛伏期明顯短于對(duì)照組(P<0.05)，勃起次數(shù)明顯多于對(duì)照組(P<0.05)；2組大鼠勃起時(shí)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組雄性大鼠陰莖勃起反射情況比較

2.5β-廣藿香烯對(duì)雄性大鼠海綿體平滑肌的影響 β-廣藿香烯組的大鼠海綿體平滑肌張力隨著β-廣藿香烯濃度的升高而逐漸降低，且均低于對(duì)照組(P均<0.05)，對(duì)照組的平滑肌張力無(wú)明顯變化。見(jiàn)圖1。

圖1 β-廣藿香烯對(duì)雄性大鼠海綿體平滑肌的影響

3 討 論

性腺的發(fā)育是性功能正常的表現(xiàn)，因此動(dòng)物性腺的重量變化可反映出藥物對(duì)雄性激素強(qiáng)度的影響。交配實(shí)驗(yàn)和勃起功能反射是評(píng)價(jià)性功能的主要指標(biāo)，可用于判定受試藥物是否具有改善性功能的作用[16]。故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)計(jì)算去勢(shì)小鼠前列腺+精囊系數(shù)和包皮腺系數(shù)，觀察正常小鼠的交配行為、勃起功能反射及測(cè)定離體平滑肌張力的方法，并以鹽酸阿撲嗎啡作為觀察性行為和勃起反射的陽(yáng)性對(duì)照藥，探究了廣藿香醇及β-廣藿香烯對(duì)勃起功能及性行為的影響。在藥物配制時(shí)，由于廣藿香醇常溫下為固體，需要加溫后加入泊洛沙姆配制，才能達(dá)到所需要的藥物濃度，而β-廣藿香烯常溫下為溶液狀，使用Tween-80配制可達(dá)到所需濃度[17-18]，故廣藿香醇與β-廣藿香烯配制方法略有不同。另外因β-廣藿香烯與廣藿香醇具有化學(xué)結(jié)構(gòu)上的相似性，根據(jù)課題組前期研究結(jié)果[9，18]，選定中劑量進(jìn)行β-廣藿香烯對(duì)大鼠勃起反射影響的實(shí)驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，廣藿香醇灌胃對(duì)小鼠附性器官的臟器系數(shù)和性行為無(wú)影響，說(shuō)明廣藿香醇對(duì)去勢(shì)小鼠性器官無(wú)雄激素樣作用，但是廣藿香醇灌胃可以提高大鼠的勃起功能。前期研究證實(shí)廣藿香醇具有一定舒張陰莖平滑肌的作用，且其舒張作用與內(nèi)皮一氧化氮釋放及鈣離子通道相關(guān)[9]，同時(shí)廣藿香醇在酸性胃液條件下會(huì)代謝為β-廣藿香烯[18]，因此本研究進(jìn)一步探究廣藿香醇代謝產(chǎn)物β-廣藿香烯對(duì)陰莖平滑肌舒張的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-廣藿香烯灌胃可縮短大鼠陰莖勃起潛伏期、增加勃起次數(shù)，提高大鼠的勃起功能。此外，大鼠離體海綿體的張力實(shí)驗(yàn)也證實(shí)β-廣藿香烯可直接舒張海綿體平滑肌。而對(duì)于廣藿香醇對(duì)大鼠和小鼠的勃起功能改善情況不同，推測(cè)可能由于小鼠的胃代謝速率高于大鼠，廣藿香醇還未完全代謝為β-廣藿香烯，故未能對(duì)小鼠的海綿體平滑肌產(chǎn)生明顯作用。

綜上，筆者認(rèn)為廣藿香醇改善勃起功能既可能通過(guò)廣藿香醇本身作用于陰莖平滑肌來(lái)起效，也可能通過(guò)廣藿香醇在胃中的代謝產(chǎn)物β-廣藿香烯來(lái)起效，β-廣藿香烯可能是廣藿香醇改善大鼠勃起功能的有效成分。然而實(shí)現(xiàn)這種調(diào)節(jié)的具體分子機(jī)制，以及廣藿香醇是否對(duì)海綿體平滑肌有直接作用還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。