譚鑫，劉一如，康品方

心血管疾病是一種常見病、多發(fā)病，且致殘率和病死率很高。骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是應用最廣泛的心臟疾病臨床試驗干細胞。過去認為移植的骨髓間充質干細胞分化成心肌細胞和支持細胞類型來修復心臟組織，然而，許多觀察結果在生理上和時間上都不支持這種說法，于是出現(xiàn)了另一種說法，即移植的骨髓間充質干細胞通過分泌旁分泌因子，進一步促進組織修復，從而來介導其治療效果，目前有越來越多的證據(jù)支持MSCs以旁分泌方式起到其功能作用，如MSCs來源外泌(MSC-EXs)體可單獨作用與心肌修復，且在修復受損心肌方面優(yōu)于MSCs[1]。許多研究[2]表明，通過干細胞治療激活的心肌保護通路，也可以通過注射干細胞產(chǎn)生的外泌體來激活。

1 間充質干細胞概述

骨髓間充質干細胞是骨髓細胞中的一類，由于它們可以快速粘附在組織培養(yǎng)皿上,所以可以從其他骨髓來源的單核細胞中分離出來，MSCs約占有核細胞的0.001%～0.1%，可以在體外大量擴增而不喪失功能或表型。目前普遍認為MSCs可表達CD44、CD29、CD73、CD90和CD105，以及CD106、CD166、ICAM-1,但不表達造血標志物CD45、CD34、CD14、CD79a、CD11b和HLA-DR。在富含生長因子的選擇性培養(yǎng)基中，MSCs能夠分化為多種中胚層譜系和分化細胞類型，包括成骨細胞、脂肪細胞、骨骼肌細胞/肌管、胰島細胞和心肌細胞等。而在體內(nèi)，它們已被證明可以移植并轉分化為心肌細胞，修復梗死的心肌細胞。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，MSCs可以改善心功能,但不只是通過替換受損的心肌細胞。MSCs還分泌多種細胞因子和生長因子，這些因子以可溶性形式釋放，骨髓間充質干細胞來源外泌體能對心肌產(chǎn)生多種作用，如改善血管生成、刺激心肌干細胞和減少心肌細胞死亡。也有證據(jù)表明其能促進成纖維細胞活化，調(diào)節(jié)細胞介導的免疫應答和減輕心肌纖維化。

2 間充質干細胞來源外泌體與心血管疾病

大量研究[3-5]表明，外泌體分泌的旁分泌因子在保護心臟過程中起到重要的作用。在小鼠心臟缺血/再灌注損傷(I/R)模型中，在再灌注前用MSC來源的外泌體治療可顯著減小梗死面積[6]。再灌注前用MSCs對小鼠進行體內(nèi)治療，顯示出生物能的提高和氧化應激的降低，再灌注30 min后，經(jīng)外泌體處理小鼠的ATP/ADP和NADH/NAD+比值顯著升高。此外，外泌體治療24 h后局部和全身炎癥明顯減少[7]。而人類間充質干細胞源性外泌體(hMSC-Exo)已在多個模型中被證明可減少I/R。抑制I/R誘導的細胞凋亡和自噬在hMSC-Exo的心臟保護作用中起關鍵作用[8]。I/R損傷后細胞凋亡的主要特征是ATP生成減少、氧化應激增加和細胞凋亡。在這種情況下，缺氧會抑制有氧呼吸和ATP的產(chǎn)生，使無氧糖酵解成為ATP產(chǎn)生的主要來源。ATP生成減少是心肌缺血損傷時心肌細胞死亡的一個重要特征。MSC-Exo包含糖酵解ATP生成階段所需要的五種酶，因此研究人員推測，MSC-Exo可以增加心肌細胞中ATP的生成，并減弱其缺血后凋亡。與此推測一致，外泌體治療可以恢復能量消耗，從而抑制心肌I/R損傷后細胞的死亡。此外，在MSC-Exo中存在的過氧化物酶和谷胱甘肽S轉移酶能夠降低氧化應激，而氧化應激是導致心肌細胞死亡的一個重要原因。自噬可以通過降解受損的細胞器來產(chǎn)生ATP，從而在輕度缺血應激條件下維持細胞活力，但在嚴重缺血條件下，自噬會促進細胞死亡，使心臟功能惡化。Xiao等[9]發(fā)現(xiàn)心肌梗死后MSC移植的有益部分是由于通過主要含有miR-125b-5p的外泌體提高了自噬通量。此外，基質衍生因子1(SDF1a)在心肌梗死(MI)后具有心臟修復功能。有研究證明SDF1在MSCs來源的外泌體中過表達抑制缺血心肌細胞自噬，促進內(nèi)皮細胞微血管生成，即SDF1過表達的MSCs釋放的外泌體對缺血性心肌梗死具有有益作用[10]?？傊?，現(xiàn)有的研究表明，通過改善ATP消耗和刺激通路來抑制凋亡，MSC-Exo為心肌細胞提供了一個短時間窗口，使其有機會恢復功能障礙。急性心肌梗死由于心肌細胞再生不足而導致心力衰竭，因此，促進心肌細胞增殖是心功能恢復的關鍵。細胞周期的誘導和抑制心肌細胞增殖基因的下調(diào)可誘導心肌細胞重新進入增殖狀態(tài)。MicroRNA譜分析顯示，MSC外泌體治療后心肌細胞中一組MicroRNA發(fā)生了顯著變化[11]。Hsa-miR-590-3p能夠下調(diào)抑制細胞增殖的基因如Hopx的表達，在心肌增殖中具有良好的應用前景?；谛募〖♀}蛋白(cTnI)在梗死區(qū)微環(huán)境中的高表達，Wang等[12]利用基因轉染在間充質干細胞表面表達cTnI靶向短肽，獲得cTnI靶向外泌體。這些外泌體可沿cTnI濃度梯度定位于梗死區(qū)。攜帶hsa-miR-590-3p的外泌體被心肌細胞內(nèi)吞，從而促進心肌細胞在梗死周圍區(qū)域的增殖，最終恢復心功能。此外，GATA結合蛋白4表達的骨髓間充質干細胞外泌體誘導骨髓間充質干細胞向心肌細胞分化，減少缺氧誘導的心肌細胞凋亡，改善梗死后心肌功能[13]。最新研究發(fā)現(xiàn)，Peng等[4]通過利用MSCs源性的外泌體miR-25-3p治療心肌梗死，發(fā)現(xiàn)其是通過靶向促凋亡蛋白從而抑制心肌梗死。

3 間充質干細胞來源外泌體與血管再生

間充質干細胞通過分泌許多影響內(nèi)皮細胞生長和血管再生的蛋白從而促進血管生成，包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和肝細胞生長因子 (HGF)[14]。然而，有證據(jù)表明外泌體也介導了這一促血管生成機制的一部分[15]，Gong等[16]從MSC細胞系C3H10T1/2中分離出外泌體，發(fā)現(xiàn)外泌體在體外刺激內(nèi)皮細胞增殖。Shabbir等[17]發(fā)現(xiàn)骨髓間充質干細胞外泌體在體外刺激內(nèi)皮細胞的形成，促進成纖維細胞的增殖和遷移，另有研究[18]發(fā)現(xiàn)脂肪間充質干細胞來源的外泌體在I/R損傷時能保護皮瓣，誘導新生血管形成。最后，Hu等[19]證明MSC外泌體能夠增強小鼠后肢缺血模型的微血管密度和血液灌注，通過超濾和密度梯度純化從而誘導間充質干細胞分離出外泌體，并進一步證實其在體外刺激內(nèi)皮細胞遷移、增殖和成管。關于間充質干細胞外泌體刺激血管生成的機制，很多研究都集中在其外泌體的miRNA上。Liang等[20]發(fā)現(xiàn)miR-125a在脂肪間充質干細胞外泌體中富集，并且通過抑制DLL4促進血管生成，Gong等[16]通過實驗發(fā)現(xiàn)miR-30b在體外對刺激內(nèi)皮細胞增殖具有重要作用，在裸鼠體內(nèi)皮下注射的人臍靜脈內(nèi)皮細胞經(jīng)miR-132外泌體預處理可顯著提高其體內(nèi)血管生成能力[21]，最近的研究[22]表明，MSC-Exo通過microRNA-126過表達，同時通過PI3K/Akt信號通路促進血管生成。Chen等[23]發(fā)現(xiàn)MSC-Exo通過miR-672對骨骼再生過程中的血管生成起正向調(diào)節(jié)作用?？偟膩碚f，刺激血管生成的促血管生成miRNA的特性可能取決于MSC的來源，并且很可能隨著實驗模型的不同而變化。然而分析培養(yǎng)細胞釋放的外泌體中的miRNA相當困難，不僅因為其產(chǎn)量低，還因為血清或細胞培養(yǎng)中添加的其他物質中含有的miRNA可能相互影響[24]。

4 間充質干細胞來源外泌體與免疫調(diào)節(jié)

心血管疾病與免疫系統(tǒng)密切相關，淋巴細胞和單核巨噬細胞等參與了心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展。間充質干細胞來源的外泌體可誘導受損組織的修復，并對不同淋巴細胞的分化、活化和功能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，而骨髓間充質干細胞外泌體可能在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，它們抑制幾種免疫細胞的增殖。在B淋巴細胞中，它們通過調(diào)控相關基因mRNA的差異表達來調(diào)節(jié)細胞功能[25]。有證據(jù)表明，AFSC條件培養(yǎng)基(不含外泌體)的主要作用是誘導淋巴細胞凋亡，而AFSC來源的外泌體會降低淋巴細胞的增殖[26]。人臍帶間充質干細胞外泌體通過增加調(diào)節(jié)性T細胞的比例，降低輔助性T細胞17的比例，對體外T細胞具有免疫調(diào)節(jié)作用[27]。胎兒肝臟MSC衍生的外泌體能夠抑制NK細胞的增殖、活化和細胞毒性[28]。研究[29]發(fā)現(xiàn)，MSCs發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的一種方式是釋放脂質信號分子前列腺素E2，作為脂質，前列腺素被發(fā)現(xiàn)與外泌體的脂膜有關。然而，前列腺素E2是否參與間充質干細胞外泌體的免疫抑制機制尚未被研究。Sun等[30]通過小鼠腹腔注射阿霉素，建立擴張型心肌病模型，并靜脈注射MSC-Exos，證明了MSC-Exos依賴于JAK2-STAT6通路介導巨噬細胞極化，MSC-Exos通過調(diào)節(jié)巨噬細胞的極化，改善擴張型心肌病的炎癥微環(huán)境，有望為擴張型心肌病的臨床治療提供希望。另外Zhao[31]實驗發(fā)現(xiàn)，MSC-Exo通過miR-182改變巨噬細胞活化狀態(tài)，從而減輕小鼠心肌I/R損傷。

5 外泌體的吸收

外泌體吸收效率與細胞內(nèi)微環(huán)境活性有關，這為缺血組織外泌體的聚集提供了一種機制，MSC外泌體優(yōu)先被細胞內(nèi)pH值較低的缺血心肌細胞內(nèi)吞。盡管有明確證據(jù)表明未成熟心肌細胞能夠吸收外泌體，但外泌體能夠進入心肌細胞并將miRNA等物質傳遞給心肌細胞的具體機制尚不清楚。只有少數(shù)研究對此進行了實驗，事實上，心肌細胞對外泌體的攝取相對較少[32-34]。體內(nèi)心肌細胞攝取外泌體的證據(jù)更加有限，主要局限于基因表達改變的間接表現(xiàn)，這可能是由于miRNA的傳遞，但同樣也可能是外泌體表面蛋白激活受體的反應。另一種可能是外泌體作用于內(nèi)皮細胞 ,因為這些細胞可以吸收所有類型的外泌體，包括MSC外泌體。此外，在一些實驗中，外泌體甚至可能不是直接作用于心肌，而是作用于巨噬細胞或單核細胞。

心血管疾病領域的外泌體研究尚處于起步階段，迄今為止對此類問題的研究相對較少，這可能是由于缺乏相關知識或在研究外泌體方面存在技術困難所致。為了充分理解外泌體的裝載、靶向和傳遞的生物學機制，以及為了確定外泌體中的內(nèi)源性物質，需要進行更深入的研究。