李 琳 王春梅 柯靜霞 梁曉宇

(康博士日化集團有限公司，廣東 廣州 510655)

引言

丹皮酚，為無色或白色或微黃色有光澤的針狀結(jié)晶，是從毛茛科植物牡丹的干燥根皮中提取物出來的一種有效成分，對金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、大腸桿菌等有較強的抗菌作用[1]，具有鎮(zhèn)靜抗炎、解熱抗過敏等藥理作用。同時現(xiàn)代研究表明，丹皮酚在人體中可以迅速地吸收、代謝和排泄[2]，毒副作用小，可應(yīng)用于口腔護理領(lǐng)域，如牙膏。而利用超臨界二氧化碳萃取法從牡丹根皮提取出丹皮酚，提取率較高，丹皮酚成分不易損失破壞，生產(chǎn)工藝操作簡便，所得物含量高，色澤較淺，質(zhì)量穩(wěn)定，將其應(yīng)用于牙膏中，牙膏對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等致病細菌有較強的抑制作用[3]。

厚樸酚，為棕褐色或白色狀粉末，來源于天然植物厚樸，具有廣譜的抗菌作用，具有很好的殺滅致齲菌的效果[4]。利用此機理添加到牙膏中，具有一定的預(yù)防和治療齲齒的作用，是一種天然植物概念的牙膏功效物添加劑。利用超臨界二氧化碳萃取法從植物厚樸中提取有效物，可以選擇性地萃取出有效成分厚樸酚(含和厚樸酚)，此工藝可以將原料中80%的有效成分選擇性萃取出來，生產(chǎn)工藝操作簡單，工藝周期短，將其用于牙膏中，牙膏對變形鏈球菌、嗜酸乳桿菌、乳桿菌等主要的致齲菌有良好的抑(殺)菌效果[5]。

蜂膠，為團塊狀或不規(guī)則碎塊，呈青綠色、棕黃色、棕紅色、棕褐色或深褐色，是蜜蜂從膠原植物新生枝芽或花蕾處采集的樹脂類物質(zhì)，摻入其上腭腺分泌物，經(jīng)蜜蜂反復(fù)加工而成的膠狀物質(zhì)。蜂膠是一種傳統(tǒng)的天然藥物，已收載于《中華人民共和國藥典》，并明確了其“補虛弱，化濁脂，止消渴；外用解毒消腫，收斂生肌。用于體虛早衰，高脂血癥，消渴；外治皮膚皸裂，燒燙傷”的功效，具有廣泛的藥理學(xué)活性。大量研究證明，將其應(yīng)用在口腔護理方面具有明顯的抑菌消炎作用，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌等病菌均有抑制、殺滅的作用。采用超臨界二氧化碳萃取法提取蜂膠，無毒、無殘留、安全，也可以避免有效成分高溫分解和氧化，其有效成分可以有效保留。

采用超臨界二氧化碳提取法提取丹皮酚、厚樸酚、蜂膠，可避免了傳統(tǒng)工藝中由于高溫、長時間使得原有成分發(fā)生改變的不足，有效減少了功效成分的散失。同時利用三者的功效配合應(yīng)用于牙膏上，可使牙膏在抑制牙菌斑、減輕牙齦炎癥方面產(chǎn)生協(xié)同增效的效應(yīng)，從而在口腔護理方面達到理想的效果，也對于傳統(tǒng)天然藥物應(yīng)用于現(xiàn)代口腔護理用品具有積極的意義。

1 功效物體外抑菌實驗

1.1 溶液配制

同一總量各功效物(超臨界提取)配比方案如表1。

表1 同一總量各功效物(超臨界提取)配比

試驗樣品溶液配制：參照高玉云[6]對厚樸酚和丹皮酚的配制方法，以無菌操作各取表1方案樣品，先加入少量無水乙醇，再加入吐溫20和蒸餾水(吐溫和乙醇含量不超過0.5%)，超聲乳化后放入94ml滅菌0.03mol/L磷酸緩沖液(pH=7.2)中，充分震蕩溶解，配成1%的均勻分散的懸液。

1.2 試驗方法

依據(jù)《日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的評價方法(QB/T 2738-2012)》7.3懸浮定量法，測試不同方案的試驗樣品對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌、變形鏈球菌的抑菌率來評價不同組合比例的抑菌效果。

實驗步驟參照標準《QB/T 2738-2012》7.3.3，試驗菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 6538、大腸桿菌8099、白色念珠菌ATCC 10231、變形鏈球菌ATCC 25175，作用時間為3min，抑菌率計算公式如下：

式中：Ⅰ——對照樣品平均菌落數(shù);

Ⅱ——試驗樣品平均菌落數(shù)。

1.3 實驗結(jié)果

各方案抑菌實驗結(jié)果如圖1。

圖1 抑菌實驗結(jié)果

1.4 結(jié)果分析

根據(jù)圖1抑菌實驗結(jié)果所示，在功效物同一總添加量下，方案6、9、10、13、14和15對于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌、變形鏈球菌的抑菌率均在50%以上，根據(jù)《QB/T 2738-2012》中的7.3.6抑菌效果評價標準(即抑菌率50%～90%說明產(chǎn)品有抑菌作用)，可見上述方案(即三者復(fù)合物總份數(shù)分為6份，丹皮酚：厚樸酚：蜂膠提取物比重=1～3∶1～3∶2～4)對4種菌均有抑菌作用，綜合抑菌能力較強，盡管對比單一功效物或兩兩組合，在對于某一兩種菌種的抑菌效果稍有遜色，但都有較高的抑菌率，而且對于其他菌種的抑菌效果也有很大的優(yōu)勢，可見，將三者進行復(fù)配，可以發(fā)揮各自互相協(xié)同增效的作用，可將上述方案的復(fù)合物應(yīng)用于牙膏上。

2 牙膏試驗部分

2.1 試驗原料

保濕劑(PEG-400、山梨醇)；味覺改良劑(糖精鈉)；防腐劑(苯甲酸鈉)；著色劑(二氧化鈦)；增稠劑(羧甲基纖維素鈉、漢生膠)；發(fā)泡劑(十二醇硫酸鈉)；磨擦劑(二氧化硅)；功效物；食用香精；去離子水余量。

2.2 試驗主要儀器和設(shè)備

電動攪拌機(IKA，RW20.n型)；電熱恒溫干燥箱(上海躍進，GZX-DH-50X55-s)；電子天平(METTLER，TOLEDO AG204)；制膏試驗機(FRYMA，VME-12)；超聲波封尾機(成久，QDFW-125)。

2.3 成分選擇及配比

2.3.1 保濕劑

主要作用是讓制成的牙膏膏體保持濕潤、保持一定的水分，當(dāng)膏體外露在空氣中時，能有效防止膏體中的水分蒸發(fā)流失，也預(yù)防牙膏成品在保存期間管口處的牙膏不易干結(jié)，易于擠出，便于消費者使用；同時也利于改善保持膏體的流變性，生產(chǎn)上便于灌裝；降低冰點；提高牙膏的穩(wěn)定性。

配方采用的是PEG-400與山梨醇復(fù)配，PEG-400具有很好的保濕功能，冰點比甘油低，具有抗凍性能，也有溶解牙漬的作用；山梨醇是一種常用的牙膏保濕劑。研究表明，保濕效果比甘油更穩(wěn)定，在較低濕度時，山梨醇散失水分較甘油低，在較高濕度時，吸收水分也較甘油低，具有非常良好的抗凍性，口味較好。此配方保濕劑用量和為45%～55%。

2.3.2 味覺改良劑

用來改善牙膏的口感，掩蓋牙膏某些成分的不良口味。

配方采用的是糖精鈉，人工合成甜味劑，歷史悠久，應(yīng)用穩(wěn)定，廣泛應(yīng)用于牙膏中，用量為0.20%～0.25%。

2.3.3 防腐劑

防止和抑制牙膏微生物的生長，避免牙膏膏體的腐敗、變質(zhì)。

配方采用的是苯甲酸鈉，因配方體系為二氧化硅做磨料，而且有較高比例的醇類保濕劑，苯甲酸鈉已完全能夠應(yīng)對該配方的防腐，用量為0.2%～0.3%。

2.3.4 著色劑

改變牙膏外觀。

配方采用的是二氧化鈦，化學(xué)性質(zhì)極為穩(wěn)定，與其他白色顏料比較有優(yōu)越的白度、著色力、遮蓋力、耐候性、耐熱性和化學(xué)穩(wěn)定性，沒有毒性，可以減弱配方二氧化硅體系透明的感覺，也可適當(dāng)減輕膏體因功效物引起的顏色發(fā)黃等，用量為0.3%～0.6%。

2.3.5 增稠劑

保證牙膏穩(wěn)定性的關(guān)鍵、主導(dǎo)原料，可以使牙膏具有適當(dāng)?shù)恼扯?、稠度以及良好的流動、成條性能，并讓消費者在刷牙時讓膏體容易分散，可以使得牙膏體系中的粉末穩(wěn)定分散在液相中，保證牙膏膏體保持穩(wěn)定的狀態(tài)。

配方采用的是羧甲基纖維素鈉和漢生膠復(fù)配，羧甲基纖維素鈉是目前國內(nèi)外普遍使用的牙膏增稠劑，價格便宜，具有增稠、穩(wěn)定膏體的作用，但黏度受可溶性電解質(zhì)特別是鈉鹽和重金屬的影響較大，還容易受酶的作用發(fā)生生物降解，因此在此配方復(fù)配了漢生膠，增加膏體抗鹽、抗酶性能，也改善了膏體的分散性、外觀、口感以及灌裝性能，用量和為0.8%～1.2%。

2.3.6 發(fā)泡劑

讓膏體在刷牙磨擦?xí)r產(chǎn)生豐富的泡沫，給予消費者一定的感官體驗，同時起到清除牙垢、清潔口腔的目的，并且有一定的乳化作用，可以有助于香精等油溶性物質(zhì)與膏體中的其他成分形成穩(wěn)定的體系。

配方采用的是十二烷基硫酸鈉，是目前最常用的牙膏發(fā)泡劑，相比較于其他發(fā)泡劑，在價格以及發(fā)泡力具有很好的性價比，也具有優(yōu)異的去污、乳化和發(fā)泡力，用量為2.0%～3.0%。

2.3.7 磨擦劑

牙膏的主體原料，作用是去除牙垢，減輕牙結(jié)石等。

配方采用的是二氧化硅，安全無毒，呈化學(xué)惰性，不與配方中的丹皮酚、厚樸酚、蜂膠功效物以及香精等發(fā)生反應(yīng)，具有良好的相容性，并具有卓越的貯存穩(wěn)定性，可以提高膏體中功效物的穩(wěn)定性，用量為20%～25%。

2.3.8 功效物

使得牙膏可以實現(xiàn)除清潔基本功能之外的功效的成分。

配方采用的功效物是超臨界二氧化碳提取法提取的丹皮酚、厚樸酚、蜂膠復(fù)合物。

根據(jù)前述的功效物體外抑菌實驗結(jié)果可知，方案6、9、10、13、14和15(即三者復(fù)合物總份數(shù)分為6份，丹皮酚∶厚樸酚∶蜂膠提取物比重=1～3∶1～3∶2～4)在對于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌、變形鏈球菌的綜合抑菌能力較好，均有抑菌作用，復(fù)合物用量為0.5%。

2.3.9 食用香精

賦予牙膏香氣和口感，掩蓋某些成分的異味，給予產(chǎn)品特定風(fēng)格的標簽認知，用量為1.0%～1.5%。

2.4 方案設(shè)計

分別按照方案6、9、10、13、14和15(即三者復(fù)合物總份數(shù)分為6份，丹皮酚∶厚樸酚∶蜂膠提取物比重=1～3∶1～3∶2～4)，將復(fù)合物以0.5%的總添加量添加至牙膏中，牙膏中其余成分配比見表2。

表2

2.5 工藝操作

準確稱取各物料，預(yù)先將食用香精、超臨界二氧化碳提取法提取的丹皮酚、厚樸酚、蜂膠復(fù)合物溶解均勻，將糖精鈉、苯甲酸鈉、去離子水加入攪拌釜中，溶解均勻后，再加入PEG-400、山梨醇，攪拌2分鐘后，再將二氧化硅、二氧化鈦、羧甲基纖維素鈉、漢生膠加入攪拌釜中，開啟真空泵、刮板和雙攪拌，計時15～25分鐘，加入預(yù)先溶解好功效物的香精液，繼續(xù)攪拌計時10分鐘，停雙攪拌，保持刮板繼續(xù)運行，在真空度達到-0.094MPa以上保持抽泡5分鐘，停攪拌，出料。

2.6 性能測定

2.6.1 穩(wěn)定性判定

將制好的牙膏成品放置于45℃的電熱恒溫干燥箱中，放置3個月后取出與常溫儲存的樣品進行對比，觀察高溫樣品的外觀、香味、pH值等變化，以此來推論3年保質(zhì)期內(nèi)牙膏的穩(wěn)定性。

2.6.2 抑菌性能測試

依據(jù)《日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的評價方法(QB/T 2738-2012)》7.3懸浮定量法測試不同功效物添加量的成品牙膏對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌、變形鏈球菌的抑制效果。

實驗步驟參照標準《QB/T 2738-2012》7.3.3，試驗菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 6538、大腸桿菌8099、白色念珠菌ATCC 10231、變形鏈球菌ATCC 25175，作用時間為3min，抑菌率計算公式如下：

式中：Ⅰ——對照樣品平均菌落數(shù);

Ⅱ——試驗樣品平均菌落數(shù)。

2.7 試驗結(jié)果

2.7.1 穩(wěn)定性測試結(jié)果

穩(wěn)定性測試結(jié)果如表3所示。

表3 穩(wěn)定性測試結(jié)果

2.7.2 抑菌性能測試結(jié)果

抑菌性能測試結(jié)果如表4所示。

表4 抑菌性能測試結(jié)果

2.7.3 結(jié)果分析

根據(jù)《QB/T 2738-2012》7.3.6抑菌效果評價標準抑菌率50%～90%，可表明產(chǎn)品有抑菌作用，由上述的穩(wěn)定性及抑菌性能測試結(jié)果可知，各方案所得牙膏有抑菌作用，并且通過穩(wěn)定性測試，各項指標符合牙膏國家標準要求。

3 臨床試驗

3.1 試驗方法及目的

采用隨機、雙盲、平行對照臨床試驗的方法，使用含有超臨界萃取的丹皮酚、厚樸酚和蜂膠復(fù)合物的牙膏(取上述方案9)為實驗組，使用不含活性牙膏組(除方案9中的復(fù)合物和水外，其他組分種類和含量均相同，其中水為余量)為對照組，為期三個月，評估在無監(jiān)督情況下日常家庭使用待測產(chǎn)品每天至少兩次，是否有抑制牙菌斑和減輕牙齦炎癥的效果。受試者為廣州市內(nèi)符合納入及排除標準的72名健康成年男性和女性。

3.2 試驗過程

使用牙齦指數(shù)(gingival index，GI)、探診出血百分比(percentage of bleeding on probing,BOP%)評價牙齦炎情況，使用菌斑指數(shù)(plaque index，PI)評價牙菌斑情況，在試驗開始、試驗1個半月、3個月進行全口牙臨床檢查，每顆牙檢查6個位點，并記錄口腔軟硬組織是否正常。受試者每天使用統(tǒng)一分發(fā)的牙刷和牙膏刷牙兩次，每次至少1分鐘。A組為實驗組，分發(fā)牙膏A(含超臨界提取的丹皮酚、厚樸酚和蜂膠牙膏)；B組為對照組，分發(fā)牙膏B(無添加功效物牙膏)。

3.3 試驗結(jié)果

72名參加試驗的志愿者中，有69名完成了全部(3個月)的試驗，共有3名受試者中途退出，其數(shù)據(jù)未納入統(tǒng)計分析。

試驗組和對照組的平均年齡和性別如表5。

表5 兩組年齡和性別情況

試驗組和對照組試驗各項指標如表6。

表6 試驗組與對照組各項指標

試驗組和對照組結(jié)束與基線各項指標比較結(jié)果如表7。

表7 結(jié)束與基線各項指標比較

2.4 分析與討論

如上述統(tǒng)計表所示，試驗組和對照組的平均年齡和性別分布無顯著性差異，基線檢查各項指標無顯著性差異。通過3個月的試驗結(jié)果表明，試驗組的菌斑量、牙齦炎程度、探診出血百分比值表現(xiàn)為逐漸下降趨勢；而對照組只有牙齦炎程度呈下降趨勢，而菌斑量、探診出血百分比值在試驗結(jié)束時較試驗中段有輕微升高。試驗結(jié)束時，試驗組和對照組各項檢查指標較基線檢查時有不同程度減低，試驗組牙齦炎和菌斑的各項檢查指標均校對照組減輕，差異程度是顯著性的，其中菌斑改善率23.50%，牙齦炎改善率21.2%，探診出血百分比改善率23.0%，并且均無觀察到口腔軟硬組織副作用。

臨床研究的結(jié)果證明，與普通無功效物的對照組牙膏對比，使用本文研制的含超臨界提取的丹皮酚、厚樸酚、蜂膠牙膏可以有效地抑制牙菌斑和減輕牙齦炎癥。

3 小結(jié)

利用超臨界二氧化碳提取的丹皮酚、厚樸酚、蜂膠三者抑菌消炎等相輔相成、協(xié)同增效的功效應(yīng)用在牙膏上，牙膏質(zhì)量穩(wěn)定，可有效抑制牙菌斑和減輕牙齦炎癥，對于傳統(tǒng)中草藥應(yīng)用于現(xiàn)代口腔護理用品也具有積極的意義。