吳金平 楊代勤 杜 浩 羅 江 熊 偉 劉 源 危起偉* 朱建強*

(1.長江大學農學院，荊州 434025；2.中國水產科學研究院長江水產研究所，農業(yè)農村部淡水生物多樣性保護重點實驗室，武漢 430223)

二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)與花生四烯酸(arachidonic acid，ARA)是海洋生物重要的長鏈高不飽和作脂肪酸，對魚類有著重要的生理作用。海水魚類中，一般DHA與EPA有利于魚類生長，并且魚體缺乏將亞麻酸(18∶3n-3)轉化成DHA與EPA的能力，因此將DHA與EPA當作海水魚類的必需脂肪酸，從而忽略了ARA相關的研究[1-4]。隨著飼料添加ARA后的重要作用越來越突出，目前關于ARA的研究亦越來越多。ARA已經表現出具有影響海水魚類的存活與生長[5-10]、抗應激[11-12]、脂質代謝[13-14]、激素合成[15-17]、色素調控[18-20]、免疫調控[21-22]及親魚的繁殖性能[23-24]等一系列的生理調控作用。相比于海水魚類，淡水魚類ARA的相關研究更少，這與淡水魚類必需脂肪酸的滿足可以通過亞油酸與亞麻酸的獲取來實現以及淡水魚類對ARA的需求量很小等因素有關[4]。值得關注的是最近有許多淡水魚類也表現出飼料添加ARA后會促進其生長、調控脂質代謝與提高親魚的繁殖性能等重要的生理功能[25-27]；同時，有學者提出鱘魚不具備將亞油酸轉化為ARA的能力[28]，這意味著ARA在鱘魚上的生理功能需要重新定位。

中華鱘作為一種江海洄游型魚類，具有體型大、壽命長與性成熟周期長等特點，由于涉水工程建設、捕撈、航運及污染等人類活動的影響，其賴以生存的棲息環(huán)境已經退化或功能喪失，導致其自然種群嚴重衰退，目前已被列入我國國家一級重點保護動物[29-31]。Zhou等[32]、Liu等[33]提出ARA是中華鱘性腺發(fā)育及其生長中的關鍵營養(yǎng)物質。Leng等[34]基于轉錄組學與代謝組學的研究表明飼料中18%的脂肪水平促進了ARA的代謝且有利于中華鱘性腺發(fā)育。這些研究結果表明ARA是人工淡水養(yǎng)殖環(huán)境下的重要營養(yǎng)因子。當前，關于中華鱘ARA相關的營養(yǎng)研究尚未見報道。基于此，本試驗擬配制4種不同ARA含量的試驗飼料，養(yǎng)殖性腺發(fā)育處于Ⅱ期的4齡子二代中華鱘22周，考察ARA對其成活與生長、抗氧化能力、組織ARA代謝酶活性及腸道菌群組成的影響，從而為人工養(yǎng)殖環(huán)境下中華鱘養(yǎng)殖提供ARA營養(yǎng)學參數。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料配制

采用秘魯魚粉、脫脂豆粕、酪蛋白與明膠作為蛋白質源，面粉作為糖源，魚油與ARA純化油作為主要的脂肪源，通過在基礎飼料中添加0、0.5%、1.0%和2.0%的ARA純化油(ARA占總脂肪酸的44.88%)，制成4種等氮等能的試驗飼料，經氣相色譜檢測，試驗飼料中ARA含量分別為0.18%、0.53%、0.96%和1.89%。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1，試驗飼料主要脂肪酸組成見表2。飼料制作前，將所有的原料粉碎后過60目分級篩，按照配方分別稱取相應重量的飼料原料，混合，少量的成分采用逐級預混法混合，與魚油、ARA純化油混合后，最后加入約20%的水，再次混勻，用顆粒飼料機(KL-210)制成直徑約5.80 mm、長約12.00 mm的條形狀顆粒飼料，于室內陰涼干燥處電風扇吹干后，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) %

續(xù)表1項目Items飼料ARA含量DietaryARAcontent/%0.180.530.961.89酵母粉Yeastpowder1.001.001.001.00微晶纖維素Micro-cellose2.802.802.802.80羧甲基纖維素鈉Sodiumcarboxymethylcellulose2.002.002.002.00合計Total100.00100.00100.00100.00營養(yǎng)水平Nutrientlevels2)水分Moisture10.2110.3610.219.88粗蛋白質Crudeprotein42.6742.1741.9042.34粗脂肪Crudelipid13.9313.5013.2113.80

表2 試驗飼料主要脂肪酸組成 Table 2 Main fatty acid composition of experimental diets %

續(xù)表2脂肪酸Fattyacids飼料ARA含量DietaryARAcontent/%0.180.530.961.89Σn-3PUFA29.3127.4925.8722.57DHA/EPA1.371.411.401.45Σn-3PUFA/Σn-6PUFA4.783.021.971.11

1.2 試驗魚與養(yǎng)殖管理

試驗魚來源于中國水產科學研究院長江水產研究所農業(yè)農村部中華鱘保護與增殖放流中心2016年繁殖的子二代中華鱘，該批子二代中華鱘養(yǎng)殖于直徑長14 m，寬7 m，水深1 m的橢圓形水泥池中。試驗開始前，采用學科組雌雄性別特異性分子標記方法對該批試驗魚進行雌雄性別鑒定。鑒定完成后，將72尾初始體重為(4.17±0.22)kg的試驗魚(性別比為1∶1)隨機分配到12個圓形流水養(yǎng)殖水泥池(直徑3 m，水深0.5 m)中，每個養(yǎng)殖池放養(yǎng)18條魚，每種飼料投喂3個養(yǎng)殖池，養(yǎng)殖22周。養(yǎng)殖期間采用表觀飽食法投喂，每天投喂2次(08:00和20:00)，投食量約為魚體重的1%，每餐實際投喂量因魚的攝食情況而變化，每天定時排污1次，排水量約為池水的1/3。養(yǎng)殖期間水溫18.0～21.4 ℃，溶氧濃度>5.56 mg/L，pH 7.91～8.19，氨氮濃度<0.5 mg/L，鐵離子濃度為0.037～0.077 mg/L，水體濁度為0.50～1.79 NTU。

1.3 樣品采集與測定

養(yǎng)殖試驗結束后，試驗魚饑餓24 h，每組隨機挑選6尾雌魚麻醉，測量體重與體長。將魚體表面的水擦干后，采集血液，血液于4 ℃冰箱過夜澄清后于3 000×g、4 ℃離心15 min，收集上清液用于抗氧化指標的檢測；解剖魚體后，剝離肝臟與性腺組織，用于測定組織抗氧化指標及ARA代謝酶活性。接著，剝離后腸的腸道內容物于無菌凍存管中，所有樣品于液氮速凍后，立即置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

根據下列公式，計算增重率(weight gain rate，WGR)與成活率(survival rate，SR)。

增重率(%)=[(W1-W0)/W0]×100；成活率(%)=(N1/N0)×100。

式中:W1為每個養(yǎng)殖池終末體質量(kg)；W0為每個養(yǎng)殖池初始體質量(kg)；N1為終末尾數；N0為初始尾數；

飼料粗蛋白質、粗脂肪含量分別采用凱氏定氮法、索氏抽提法測定。飼料水分含量采用103 ℃恒溫干燥失重法測定。飼料脂肪酸含量采用液相色譜儀(GC-2030，Shimadzu，日本)測定，色譜柱型號為DB-WAX-30M I.D.0.32 mm。

肝臟與血清中谷胱甘肽硫轉移酶(glutathione S-transferase，GST)、過氧化氫酶(peroxidase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD))活性與丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量以及肝臟與性腺組織中環(huán)氧合酶-1(cyclooxygenase-1，COX-1)、環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)、脂氧合酶(lipoxgenase，LOX)與細胞色素氧化酶P450(cytochrome P450，CYP450)活性均采用江蘇酶免實業(yè)有限公司生產的試劑盒測定。

1.4 腸道菌群多樣性分析

1.4.1 DNA提取與PCR擴增

1.4.2 PCR產物的混樣和純化

PCR產物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；對檢測合格的PCR產物進行磁珠純化，采用酶標定量，根據PCR產物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，對目的條帶使用QIAGEN公司提供的膠回收試劑盒回收產物。

1.4.3 文庫構建和上機測序

1.5 數據處理與分析

除腸道菌群組成外的所有數據經SPSS 22.0統計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Tukey HSD進行組間多重比較，顯著性水平設置為P<0.05。試驗結果以平均值±標準誤(mean±SE)表示。

2 結果與分析

2.1 飼料ARA含量對子二代中華鱘成活與生長的影響

飼料ARA含量對子二代中華鱘成活與生長的影響見表3。經過22周的養(yǎng)殖，飼料中不同含量的ARA對試驗魚的終末體重、增重率及成活率均未產生顯著影響(P>0.05)。

表3 飼料ARA含量對子二代中華鱘成活與生長的影響Table 3 Effects of dietary ARA content on survival and growth of F2 generation Chinese sturgeon

2.2 飼料ARA含量對子二代中華鱘肝臟與血清抗氧化指標的影響

飼料ARA含量對子二代中華鱘肝臟與血清抗氧化能力的影響見表4。試驗魚經過22周的養(yǎng)殖后，1.89% ARA組肝臟SOD活性顯著高于0.18%與0.53%ARA組(P<0.05)，與0.96%ARA組無顯著差異(P>0.05)。1.89%ARA組肝臟CAT活性顯著高于0.18%與0.53%ARA組(P<0.05)，與0.96%ARA組無顯著差異(P>0.05)。1.89%ARA組肝臟MDA含量最低，與0.18%、0.53%及0.96%ARA組差異顯著(P<0.05)。0.18%ARA組肝臟GST活性顯著低于1.89%ARA組(P<0.05)，與0.53%與096%ARA組無顯著差異(P>0.05)。血清中SOD、CAT、GST活性與MDA含量不受飼料ARA含量的顯著影響(P>0.05)。

表4 飼料ARA含量對子二代中華鱘肝臟與血清抗氧化指標的影響Table 4 Effects of dietary ARA content on liver and serum antioxidant indexes of F2 generation Chinese sturgeon

2.3 飼料ARA含量對子二代中華鱘肝臟與性腺ARA代謝酶活性的影響

飼料ARA含量對子二代中華鱘肝臟與性腺ARA代謝酶活性的影響見表5。試驗魚經過22周的養(yǎng)殖后，性腺中COX-2與CYP450活性均以1.89%ARA組最高，且顯著高于0.18%與0.53%ARA組(P<0.05)，與0.96%ARA組無顯著差異(P>0.05)。0.96%ARA組性腺中COX-1活性顯著高于0.18%與0.53%ARA組(P<0.05)，與1.89%ARA組無顯著差異(P>0.05)。1.89%ARA組性腺中LOX活性顯著高于0.18%ARA組(P<0.05)，與0.53%及0.96%ARA組無顯著差異(P>0.05)。肝臟中，COX-1、COX-2與LOX活性均以1.89%ARA組最高且顯著高于0.18%與0.53%ARA組(P<0.05)，與0.96%ARA組無顯著差異(P>0.05)。0.18%ARA組肝臟中CYP450活性顯著低于0.96%與1.89%ARA組(P<0.05)，與0.53%ARA組無顯著差異(P>0.05)。

表5 飼料ARA含量對子二代中華鱘肝臟與性腺ARA代謝酶活性的影響Table 5 Effects of dietary ARA content on liver and gonad ARA metabolism enzyme activities of F2 generation Chinese sturgeon ng/g

2.4 飼料ARA含量對子二代中華鱘腸道菌群α多樣性的影響

飼料ARA含量對子二代中華鱘腸道菌群α多樣性的影響見表6。試驗魚經過22周的養(yǎng)殖后，其腸道菌群α多樣性受到了飼料ARA含量的影響。0.18%ARA組Chao1指數與ACE指數顯著高于0.53%ARA組(P<0.05)，與0.96%及1.89%ARA組無顯著差異(P>0.05)。Simpson指數不受飼料ARA含量的影響，各組之間無顯著差異(P>0.05)。0.18%ARA組Shannon指數與Observed-species數量顯著高于0.53%ARA組(P<0.05)，與0.96%及1.89%ARA組無顯著差異(P>0.05)。系統發(fā)育多樣性指數PD-whole tree指數不受飼料ARA含量的影響，各組之間無顯著差異(P>0.05)。

表6 飼料ARA含量對子二代中華鱘腸道菌群α多樣性的影響Table 6 Effects of dietary ARA content on intestinal microbial α diversity of F2 generation Chinese sturgeon

2.5 飼料ARA含量對子二代中華鱘腸道菌群組成的影響

將所有樣本中相對豐度不在前10的門與屬歸為其他，表7、表8分別展示了各組樣本在門與屬分類水平排名前10的菌群組成。在門分類水平下，厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)為0.18%、1.89%ARA組的優(yōu)勢菌門，厚壁菌門分別占到了49.44%、56.44%，變形菌門分別占到了19.77%、25.44%。梭桿菌門(Fusobacteriota)為0.53%、0.96%ARA組優(yōu)勢菌門，分別占到了64.59%、75.71%。上述結果表明，梭桿菌門、厚壁菌門與變形菌門是不同ARA含量飼料處理下的優(yōu)勢菌門。在屬分類水平下，0.18%ARA組活潑瘤胃球菌類群([Ruminococcus]_gnavus_group)是其優(yōu)勢屬，占比為20.73%。鯨桿菌屬(Cetobacterium)是0.53%、0.96%ARA組的優(yōu)勢菌屬，分別占到了65.54%、75.66%。鏈球菌屬(Streptococcus)是1.89%ARA組的優(yōu)勢菌屬，占比為21.58%。上述結果表明，鯨桿菌屬、活潑瘤胃球菌類群與鏈球菌屬可能是不同ARA含量飼料處理下的優(yōu)勢菌屬。

表7 飼料ARA含量對子二代中華鱘腸道菌群基于門水平的相對豐度的影響Table 7 Effects of dietary ARA content on relative abundances of intestinal microbial communities at phylum level of F2 generation Chinese sturgeon %

表8 飼料ARA含量對子二代中華鱘腸道菌群基于屬水平的相對豐度的影響Table 8 Effects of dietary ARA content on relative abundances of intestinal microbial communities at genus level of F2 generation Chinese sturgeon %

3 討 論

3.1 飼料ARA含量對子二代中華鱘成活與生長的影響

3.2 飼料ARA含量對子二代中華鱘抗氧化能力的影響

3.3 飼料ARA含量對子二代中華鱘肝臟與性腺ARA代謝酶活性的影響

游離的ARA在機體內存在著三大類酶促反應參與類二十烷酸的合成，包括經環(huán)氧合酶(COX)催化形成的前列腺素與凝血噁烷，經LOX催化形成的白三烯及不同類別的羥基二十碳四烯酸，以及經CYP450催化形成的環(huán)氧二十碳四烯酸與羥基二十碳四烯酸(HETEs)[49-51]。當前，關于飼料添加ARA后對試驗對象組織中ARA代謝酶活性的報道還很鮮見。本試驗中，性腺與肝臟中COX-1、COX-2、LOX及CYP450的活性均隨飼料ARA含量的升高而升高，表明飼料中添加ARA后對子二代中華鱘組織中ARA代謝酶具有一定的正向調控作用，同時發(fā)現同種酶活性在性腺中是高于肝臟中的，這可能表明ARA優(yōu)先沉積于性腺組織中導致其與底物結合的活性高，是否意味著ARA在中華鱘子二代性腺發(fā)育過程有著更重要的作用還需進一步研究。

3.4 飼料ARA含量對子二代中華鱘腸道菌群α多樣性的影響

本試驗中，各組樣本的Good’s coverage指數均在0.99以上，表明每組樣本達到了足夠的測序覆蓋度且本次檢測的操作分類單元(OTU)數量也足夠代表該批次抽樣群體。α多樣性指數是反映樣本內的微生物群落多樣性[52]，通過單樣本的α多樣性分析可以反映樣本內的微生物群落的豐富度和多樣性，主要包括Chao1指數、ACE指數、Shannon指數、Simpson 指數、Good’s coverage指數與PD-whole tree指數等。本試驗中，菌群豐度指數中的Chao1指數與ACE指數均以0.53%ARA組最低，在0.18%、0.96%和1.89%ARA組之間無顯著差異；同樣的，菌群多樣性指數中的Shannon指數與Simpson指數以及Observed-species數量也表現出一致的趨勢；而系統發(fā)育多樣性指數PD-whole tree指數則在各組之間無顯著差異，這可能表明飼料中含有0.18%、0.96%與1.89%的ARA有利于腸道菌群的豐富度(Chao1指數與ACE指數)和多樣性(Shannon指數與Simpson指數)。當前關于飼料中添加ARA對腸道菌群多樣性的研究僅見中間球海膽[42]相關的研究報道，現有研究中發(fā)現飼料ARA含量對中間球海膽的菌群豐富度(Chao1指數)及多樣性(Shannon指數與Simpson指數)均無顯著性影響，這可能和海膽與魚類屬于2個不同的物種密切相關。關于飼料營養(yǎng)組分影響魚類腸道菌群多樣性的研究有很多，但是不同的研究結果也不盡相同。例如，李秀玲[53]報道，不同脂肪源對ACE指數、Chao1指數、Shannon指數和Simpson指數具有顯著影響，磷蝦油組和1∶1魚油-豆油組具有較高的腸道菌群豐富度和多樣性；Xu等[54]報道，不同的鱘類攝食同種飼料，其腸道菌群的豐富度與多樣性也是不一致的，這些研究結果表明飼料組分對腸道菌群多樣性的影響不一致，也進一步表明關于飼料添加ARA后對魚類腸道菌群多樣性產生影響的問題是一個值得進一步探索的課題。

3.5 飼料ARA含量對子二代中華鱘腸道菌群組成的影響

本試驗中，在門分類水平下，梭桿菌門、厚壁菌門與變形菌門是子二代中華鱘腸道中較為豐富的門類。中間球海膽經過不同ARA含量飼料投喂后，也發(fā)現變形菌門與厚壁菌門在各組的相對豐度較高[42]。對人工養(yǎng)殖達氏鰉(Husodauricus)幼魚腸道菌群組成的分析發(fā)現厚壁菌門是其最主要的菌群(占比98.25%)[55]；對歐洲鰉(Husohuso)的研究也表明變形菌門與厚壁菌門是其優(yōu)勢菌門[54]。對長江鱘(Acipenserdabryanus)的研究也表明梭桿菌門、厚壁菌門與變形菌門是其優(yōu)勢菌門[56]。這些研究結果表明梭桿菌門、厚壁菌門與變形菌門是鱘類腸道中較為豐富的門類，本試驗中這3個菌門的相對豐度在不同ARA含量飼料處理下存在差異可能更多的與飼料ARA含量不同有關。在屬分類水平下，鯨桿菌屬在0.53%與0.89%ARA組分別占到了64.54%與75.66%，表明該屬是其優(yōu)勢菌屬，與Liu等[57]報道的鯨桿菌屬是肉食性魚類主要的菌屬之一的結果相符；在達氏鰉[55]與長江鱘[56]的研究中也檢測到了鯨桿菌屬。值得注意的是，0.18%ARA組中檢測到了相對豐度較高的活潑瘤胃球菌類群；1.89%ARA組中檢測到了相對豐度較高的乳球菌屬、鏈球菌屬、氣單胞菌屬與厭氧芽孢桿菌屬，而中間球海膽經過不同ARA含量飼料投喂后也檢測到了芽孢桿菌屬與乳球菌屬[42]；在長江鱘[56]的研究中也檢測到了氣單胞菌屬。上述這些菌屬在1.89%ARA組中的相對豐度較高，這是否有利于中華鱘子二代腸道健康及其具體原因還需進一步研究。

4 結 論

飼料中添加1.0%的ARA純化油使飼料ARA含量為0.96%時對子二代中華鱘的生長與存活無顯著影響，但能增強魚體的抗氧化能力、組織中ARA代謝酶活性及調控腸道菌群多樣性。