朱海東， 呂長(zhǎng)坤， 馬菲菲

(商丘醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校， 河南 商丘476100)

肝纖維化屬于可逆性病變，是進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是慢性肝病共同的重要病理特征，肝纖維化的特征為細(xì)胞外基質(zhì)(尤其是膠原)在肝臟內(nèi)的大量沉積[1]。肝星狀細(xì)胞的活化在肝纖維化的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，活化的肝星狀細(xì)胞可分泌α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、I型膠原蛋白(collagenI)、TIMP-1等[2，3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA是近年來(lái)RNA領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，長(zhǎng)鏈非編碼RNA可通過(guò)多種機(jī)制調(diào)控基因表達(dá)[4]，長(zhǎng)鏈非編碼TUG1是長(zhǎng)鏈非編碼RNA的重要成員之一，是缺氧引起肺纖維化的調(diào)節(jié)因子，也是心肌成纖維細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要調(diào)節(jié)因子[5]，但TUG1在肝纖維化中所發(fā)揮的作用，以及TUG1對(duì)于活化的肝星狀細(xì)胞的作用目前尚不清楚，鑒于此本文對(duì)肝纖維化組織和活化肝星狀細(xì)胞中TUG1的表達(dá)情況，以及其在肝纖維化中的可能作用機(jī)制進(jìn)行研究，為應(yīng)對(duì)肝纖維化的研究提供新的靶點(diǎn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量160-180 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2015-0016。肝星狀細(xì)胞株HSC-T6(復(fù)旦IBS細(xì)胞資源中心)，兔抗TUG1單克隆抗體、兔抗α-SMA單克隆抗體、兔抗collagenI單克隆抗體、兔抗MMP-2單克隆抗體，兔抗TIMP-1單克隆抗體、兔抗Smad2單克隆抗體、兔抗Smad3單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體、β-actin單克隆抗體(美國(guó)Epitmics公司)，BCA試劑盒、RT-PCR試劑盒、Trizol試劑盒(美國(guó)Tocris公司)，TUG1 siRNA和陰性對(duì)照siRNA(廣州銳博生物科技有限公司合成)，轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000(美國(guó)Invitrogen公司)，胎牛血清、杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)(美國(guó)Gibco公司)等。

1.2 肝纖維化大鼠模型

將30只大鼠分為對(duì)照組和肝纖維化組，每組15只，肝纖維化組大鼠給予腹腔注射1%二甲基亞硝胺(1 ml/(kg·d))，每星期連續(xù)用藥3 d，共四周；對(duì)照組大鼠給予腹腔注射等量生理鹽水，方法同肝纖維化組大鼠，共四周。建模結(jié)束后取兩組大鼠肝臟進(jìn)行HE染色和肝組織中α-SMA、TUG1水平測(cè)定。

1.3 肝臟HE染色

將大鼠的肝臟組織標(biāo)本經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋后切成厚4 μm切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色。

1.4 RT-PCR實(shí)驗(yàn)

采用Trizol試劑盒提取各兩組大鼠肝臟組織總RNA，檢測(cè)肝臟RNA純度，采用RT-PCR法測(cè)定大鼠肝組織中α-SMA、TUG1、collagenI、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3 mRNA水平：以GAPDH為內(nèi)參照，PCR反應(yīng)條件為95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。TUG1、α-SMA、collagenI、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3 mRNA相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。

GAPDHforward: 5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'；

GAPDHreverse: 5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGGTCA-3'。

α-SMAforward: 5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'；

α-SMAreverse: 5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGGTCA-3'。

collagenIforward: 5'-CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3'；

collagenIreverse: 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'。

MMP-2 forward: 5'- TACAGGATCATTGGCTACACACC-3'；

MMP-2 reverse: 5'- GGTCACATCGCTCCAGACT-3'。

TIMP-1 forward: 5'- CTTCTGCAATTCCGACCTCGT-3'；

TIMP-1 reverse: 5'- ACGCTGGTATAAGGTGGTCTG-3'。

Smad2 forward: 5'-CGTCCATCTTGCCATTCACG-3'；

Smad2 reverse: 5'-CTCAAGCTCATCTAATCGTCCTG-3'。

Smad3 forward: 5'- TGGACGCAGGTTCTCCAAAC-3'；

Smad3 reverse: 5'- CCGGCTCGCAGTAGGTAAC-3'。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的肝星狀細(xì)胞HSC-T6細(xì)胞(密度為5×105cells/well)接種到6孔板中，加入含5 ng/ml TGF-β1的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)活化肝星狀細(xì)胞，并設(shè)立對(duì)照組，對(duì)照組加入不含TGF-β1的等體積培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后提取兩組細(xì)胞總蛋白質(zhì)，測(cè)定總蛋白濃度，采用Western blot法測(cè)定細(xì)胞中α-SMA和TUG1蛋白水平，一抗為兔抗α-SMA單克隆抗體、兔抗TUG1單克隆抗體，β-actin單克隆抗體為內(nèi)參照，α-SMA和TUG1蛋白的相對(duì)表達(dá)量=α-SMA和TUG1蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

取各大鼠肝臟組織勻漿，加入細(xì)胞裂解液裂解30 min提取肝臟組織總蛋白，采用BCA法測(cè)定肝臟組織蛋白濃度，采用Western blot法測(cè)定肝組織TUG1、α-SMA、collagenI、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3 蛋白水平，一抗為兔抗TUG1單克隆抗體、兔抗α-SMA單克隆抗體、兔抗collagenI單克隆抗體、兔抗MMP-2單克隆抗體，兔抗TIMP-1單克隆抗體、兔抗Smad2單克隆抗體、兔抗Smad3單克隆抗體，β-actin單克隆抗體為內(nèi)參照，目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.6 肝纖維化模型大鼠中沉默TUG1

將45只大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為模型組、陰性對(duì)照組(沉默TUG1陰性對(duì)照)、siRNA干擾組(TUG1基因沉默組)，每組15只。三組大鼠均給予腹腔注射1%DMN(1 ml/(kg·d))，每星期連續(xù)用藥3 d，共四周建立肝纖維化模型，siRNA干擾組大鼠在建立模型的同時(shí)給予尾靜脈注射100 μg TUG1 siRNA，每周1次，陰性對(duì)照組大鼠在建立模型的同時(shí)給予尾靜脈注射陰性對(duì)照siRNA，每周1次，模型組大鼠建模時(shí)尾靜脈注射等量生理鹽水，每周1次，共4周。4周后處死大鼠取肝臟組織備用。

1.7 肝星狀細(xì)胞HSC-T6細(xì)胞轉(zhuǎn)染TUG1 siRNA

將HSC-T6細(xì)胞分為模型組、陰性對(duì)照組(沉默TUG1陰性對(duì)照)、siRNA干擾組(TUG1基因沉默組)，取三組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HSC-T6細(xì)胞(密度為5×105cells/well)接種到6孔板中，加入含5 ng/ml TGF-β1的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)活化肝星狀細(xì)胞，每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔，在活化HSC-T6細(xì)胞的同時(shí)，siRNA干擾組細(xì)胞中加入1.25 μl TUG1 siRNA(20 μmol/l)，陰性對(duì)照組細(xì)胞加入等量siRNA陰性對(duì)照，模型組不轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)6 h后移去含siRNA培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞備用。分別采用RT-PCR法和Western blot法檢測(cè)肝星狀細(xì)胞中TUG1、α-SMA、collagenI、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3 mRNA及蛋白表達(dá)水平，方法同上。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠存活情況

建立肝纖維化大鼠模型中：對(duì)照組大鼠實(shí)驗(yàn)中無(wú)死亡，肝纖維化組大鼠死亡1只；siRNA干擾的肝纖維化模型大鼠中：模型組大鼠無(wú)死亡，陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染siRNA陰性對(duì)照)和siRNA干擾組(TUG1基因沉默組)大鼠各死亡1只。

2.2 肝臟HE染色

HE染色顯示：對(duì)照組大鼠肝臟組織未見(jiàn)明顯異常，肝纖維化組大鼠肝臟組織肝細(xì)胞壞死、肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂、纖維組織增生明顯、間質(zhì)細(xì)胞彌漫增生，形成肝纖維化(圖1)。

Fig. 1 Liver pathological changes in liver fibrosis rats (HE ×200)

2.3 二組大鼠肝組織中α-SMA和TUG1 mRNA表達(dá)水平的比較

與模型組比較，肝纖維化組大鼠肝組織中α-SMA和TUG1的mRNA表達(dá)量升高(P<0.05，表1)。

Tab. 1 α-SMA and TUG1 levels in liver tissues of two groups of

2.4 二組肝星狀細(xì)胞中α-SMA和TUG1蛋白表達(dá)水平的比較

與模型組比較，TGF-β1組肝星狀細(xì)胞中α-SMA和TUG1蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05，表2，圖2)。

Tab. 2 α-SMA and TUG1 protein levels in two groups of hepatic stellate n=10)

Fig. 2 α-SMA and TUG1 protein electrophoresis

2.5 TUG1對(duì)肝纖維化大鼠肝組織TUG1、α-SMA、collagenI、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)水平的影響

與模型組和陰性對(duì)照組(沉默TUG1陰性對(duì)照)比較，siRNA干擾組(TUG1基因沉默組)大鼠肝組織TUG1、α-SMA、collagenI、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3 mRNA水平均降低(P<0.05，表3)，模型組和陰性對(duì)照組大鼠肝組織TUG1、α-SMA、collagenI、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3 mRNA水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.6 TUG1對(duì)肝纖維化大鼠肝組織TUG1、α-SMA、collagenI、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)水平的影響

與模型組和陰性對(duì)照組(沉默TUG1陰性對(duì)照)比較，siRNA干擾組(TUG1基因沉默組)大鼠肝組織TUG1、α-SMA、collagenI、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3蛋白水平均降低(P<0.05，表4，圖3)，模型組和陰性對(duì)照組大鼠肝組織TUG1、α-SMA、collagenI、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3蛋白水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Tab. 3 The mRNA levels of TUG1, α-SMA, collagenI, MMP-2, TIMP-1, Smad2 and Smad3 in rat liver tissues

Tab. 4 The protein levels of TUG1, α-SMA, collagenI, MMP-2, TIMP-1, Smad2 and Smad3 in rat liver tissues

Fig. 3 TUG1, α-SMA, collagenI, MMP-2, TIMP-1, Smad2 and Smad3 protein electrophoresis

2.7 TUG1對(duì)活化肝星狀細(xì)胞中TUG1、α-SMA、collagenI、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)水平的影響

與模型組和陰性對(duì)照組(沉默TUG1陰性對(duì)照)比較，siRNA干擾組(TUG1基因沉默組)活化肝星狀細(xì)胞TUG1、α-SMA、collagenI、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3 mRNA水平均降低(P<0.05，表5)，模型組和陰性對(duì)照組活化肝星狀細(xì)胞TUG1、α-SMA、collagenI、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3 mRNA水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.8 TUG1對(duì)活化肝星狀細(xì)胞TUG1、α-SMA、collagenI、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3 蛋白表達(dá)水平的影響

與模型組和陰性對(duì)照組(沉默TUG1陰性對(duì)照)比較，siRNA干擾組活化肝星狀細(xì)胞TUG1、α-SMA、collagenI、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3蛋白水平均降低(P<0.05)，模型組和陰性對(duì)照組(沉默TUG1陰性對(duì)照)活化肝星狀細(xì)胞TUG1、α-SMA、collagenI、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3蛋白水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表6，圖4)。

Tab. 5 The mRNA levels of TUG1, α-SMA, collagenI, MMP-2, TIMP-1, Smad2 and Smad3 in activated hepatic stellate n=7)

Tab. 6 The protein levels of TUG1, α-SMA, collagenI, MMP-2, TIMP-1, Smad2 and Smad3 in activated hepatic stellate n=7)

Fig. 4 TUG1, α-SMA, collagenI, MMP-2, TIMP-1, Smad2 and Smad3 protein electrophoresis

3 討論

長(zhǎng)鏈非編碼RNA長(zhǎng)度大于200nt，是一種沒(méi)有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA，長(zhǎng)鏈非編碼RNA可調(diào)控多種基因表達(dá)，具有廣泛的生物學(xué)功能，可以和微小RNA相互作用發(fā)揮生物學(xué)功能[6]，如：長(zhǎng)鏈非編碼RNA可作為增強(qiáng)子RNA和前體微小RNA結(jié)合調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄；通過(guò)調(diào)節(jié)抑癌基因影響抑癌信號(hào)通路；可為染色質(zhì)修飾復(fù)合物提供支架；充當(dāng)微小RNA調(diào)節(jié)基因的表達(dá)；與相應(yīng)的mRNA剪接前體形成雙鏈RNA，并被剪切酶切割形成小干擾RNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)；和其它長(zhǎng)鏈非編碼RNA之間相互作用調(diào)節(jié)基因表達(dá)，長(zhǎng)鏈非編碼在肝纖維化中發(fā)揮重要作用[7，8]。長(zhǎng)鏈非編碼TUG1為長(zhǎng)鏈非編碼RNA的一種，具有多種生物學(xué)特性[9，10]，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)[11，12]，與惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移關(guān)系密切[13，14]；TUG1在組織纖維化中也發(fā)揮重要作用[15]，為肺部纖維化的調(diào)節(jié)因子之一，在心臟纖維化中也具有重要作用。Zhu Y等[15]研究發(fā)現(xiàn)，TUG1和心肌纖維化程度呈正相關(guān)，敲低TUG1可改善缺氧誘導(dǎo)的心肌纖維化。但TUG1在肝纖維化中的表達(dá)尚不清楚，本文研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠肝纖維化組織中及活化的肝星狀細(xì)胞中TUG1表達(dá)水平升高，提示TUG1可能參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵為肝星狀細(xì)胞的活化，肝星狀細(xì)胞的活化也是肝纖維化時(shí)細(xì)胞外機(jī)制的主要來(lái)源細(xì)胞。正常情況下，肝星狀細(xì)胞合成一定量的細(xì)胞外基質(zhì)(以膠原Ⅲ和膠原Ⅳ為主)，當(dāng)肝臟受到刺激時(shí)，肝星狀細(xì)胞被激活，轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，表達(dá)α-SMA，合成大量膠原等細(xì)胞外基質(zhì)，使肝臟內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)增多，使collagen Ⅳ為主的基底膜改變?yōu)橐詂ollagen I和collagen Ⅲ膠原為主的基底膜，并進(jìn)一步激活肝星狀細(xì)胞，啟動(dòng)肝纖維化，肝星狀細(xì)胞分泌α-SMA為肝星狀細(xì)胞激活的標(biāo)志[16，17]；MMP-2在正常肝組織中很少表達(dá)，主要由肝星狀細(xì)胞活化后產(chǎn)生，在肝纖維化過(guò)程中MMP-2水平升高[18]；TIMP-1可以特異性抑制間質(zhì)膠原酶、基質(zhì)降解酶等，在降解細(xì)胞外基質(zhì)主要成分collagen I中發(fā)揮關(guān)鍵作用[19]。肝星狀細(xì)胞活化后分泌α-SMA、collagen I、MMP-2、TIMP-1是肝纖維化進(jìn)展的關(guān)鍵步驟[20]。本研究沉默TUG1后，肝纖維化組織及活化肝星狀細(xì)胞中TUG1、α-SMA、collagen I、MMP-2、TIMP-1水平均降低，提示降低TUG1水平可逆轉(zhuǎn)肝星狀細(xì)胞活化，并且HE實(shí)驗(yàn)也表明降低TUG1水平可以明顯改善肝纖維化的病理過(guò)程，改善肝纖維化所造成的病理性損傷。

活化的肝星狀細(xì)胞受多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)，TGF-β1是最有效的促肝纖維化的細(xì)胞因子，TGF-β1可通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的基因表達(dá)，Smad蛋白依賴途徑是最經(jīng)典的途徑[21]。Smad2和Smad3是細(xì)胞內(nèi)TGF-β1/Smad信號(hào)通路的的下游信號(hào)蛋白，在TGF-β1/Smad信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，可以間接反映TGF-β1/Smad信號(hào)通路的激活情況，在肝纖維化過(guò)程中，TGF-β1/Smad信號(hào)通路被激活，從而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展[22，23]。本文沉默TUG1后，肝纖維化組織及活化肝星狀細(xì)胞中Smad2和Smad3水平下降，提示TUG1可能通過(guò)抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路的激活, 進(jìn)而抑制肝星狀細(xì)胞細(xì)胞的激活，在抗肝纖維化中發(fā)揮作用。

綜上所述，在肝纖維化時(shí)肝組織中與活化的肝星狀細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)，TUG1無(wú)論是蛋白表達(dá)水平還是基因表達(dá)水平都顯著升高，而下調(diào)TUG1水平不僅可以顯著改善肝臟的病理性損傷，還可通過(guò)逆轉(zhuǎn)肝星狀細(xì)胞的活化抑制肝纖維化，其機(jī)制可能為T(mén)UG1通過(guò)抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路的激活發(fā)揮抗肝纖維化的作用。因此本文的研究結(jié)果表明，在整體水平和基因水平上TUG1在肝纖維化病理進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用; 同時(shí)TUG1有望成為肝纖維化的治療靶點(diǎn)之一。