王亞麗 沈曉麗 王秀霞 李海芳

(新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中藥(維藥)質(zhì)量控制重點實驗室，烏魯木齊 830054)

測量不確定度是表征合理地賦予被測量之值的分散性，是測量系統(tǒng)最基本的特性指標[1]。測量不確定度是衡量測試結(jié)果準確定和可靠性的重要參數(shù)，結(jié)果的表述同時包含被測量值及其測量不確定度才完整并有意義[2]。HPLC法是藥物分析中的常用方法[3-8]，本文以硝苯地平片含量測定為例，參考 JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[9]和《化學分析中不確定度的評估指南》[10]的要求，建立HPLC法測量不確定度評定的通用模型，可為測量數(shù)據(jù)的準確性和可靠性提供參考。

1 材料與方法

1.1 方法依據(jù)

硝苯地平片HPLC法含量測定按《中國藥典》[11]2015年版四部通則0512，采用高效液相色譜外標法測定，計算硝苯地平含量。

1.2 儀器及試劑

1.2.1儀器

高效液相色譜儀，LC-20A，峰面積重復(fù)性限為0.1%；電子天平，XS 205DU，最大量程Max=81g，實際分度值d=0.01mg，檢定分度值e=0.1mg，量程最大允許誤差MPEV=0.02mg(10mg～5g)。

1.2.2試劑

對照品為硝苯地平標準品(批號：100338-201404，規(guī)格：20mg，99.9%)；供試品為硝苯地平片(批號為150503，標示量為5mg/片)；試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 實驗方法

1.3.1色譜條件

流動相為甲醇∶水(60∶40)；流速1.0mL/min；色譜柱選擇C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱溫為35 ℃；進樣量為20μL；檢測波長235nm。

1.3.2對照品溶液的制備

取硝苯地平對照品約10mg，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋至10mL，再精密量取1mL定量稀釋至50mL，作為對照品溶液。

1.3.3供試品溶液的制備

1.4 數(shù)學模型

檢驗指標：應(yīng)為標示量的90.0%～110.0%

(1)

式中：

c對—對照品溶液中硝苯地平的濃度，g/mL；

A供—供試品的峰面積；

A對—對照品的峰面積；

c供—供試品溶液中硝苯地平的濃度，g/mL；

w標示量—標示量，本例為0.005g/片；

考慮到被測量的重復(fù)性影響不可忽略，加入重復(fù)性影響后，被測量按下式計算：

X′=X+XR

(2)

式中：

X′—加入重復(fù)性影響后的含量，%；

2 不確定度評定

2.1 不確定度來源分析

不確定度來源用因果圖表示，見圖1、圖2。

圖1 考慮重復(fù)性后不確定度來源因果圖

圖2 硝苯地平相對含量的不確定度來源因果圖

2.2 合成標準不確定度表達式

各輸入量不相關(guān)，由式(2)得合成標準不確定度表達式如下：

(3)

由式(1)，依據(jù)JJF 1135-2005《化學分析測量不確定度評定》[11]，忽略相關(guān)性，得：

(4)

2.3 標準不確定度的評定

2.3.1評定u(X)

2.3.1.1評定對照品溶液的濃度c的相對方差ur(c)

硝苯地平對照品由中國食品藥品檢定研究院提供，僅給出純度為99.9%，并未給出其不確定度信息，故在此不對其進行評定，僅評定配制對照品溶液濃度帶來的不確定度。對照品溶液的濃度不確定度由對照品稱樣量m對(10.05mg)和10mL容量瓶(A級)、50mL容量瓶(A級)和1mL移液管(A級)引入，由于c對=m對/V對，兩輸入量不相關(guān)，則：

(5)

(1)評定ur(m對)

對照品稱樣量m對(10.05mg)的不確定度由天平引入，天平的不確定度來源主要考慮允許誤差和重復(fù)性誤差，其中將重復(fù)性誤差帶來的不確定度含于整個測量過程的重復(fù)性XR之中。查天平檢定證書，量程為10mg～5g的允差為±0.05mg，認為允差帶來的不確定度屬于矩形分布，則：

(2)評定ur(V對)

10mL容量瓶(A級)的不確定度來源主要考慮容量允許誤差及溫度影響，兩者不相關(guān)。查JJG196-2006《中華人民共和國國家計量檢定規(guī)程常用玻璃量器》[12]，容量為10mL的容量瓶(A級)容量允許誤差為±0.020mL，認為是三角分布，則：

本次測量時實驗室的溫度為22℃，容量瓶校準時為20℃，由于液體的膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹，故只考慮液體的體積膨脹，配置硝苯地平對照品的溶劑為甲醇，甲醇的膨脹系數(shù)為0.00118℃-1，因此產(chǎn)生的體積增量為10×0.00118×2=0.0236mL，視體積增量為變化范圍半寬，假設(shè)體積變化服從三角分布，則：

查JJG 196-2006，容量為50mL的容量瓶(A級)容量允許誤差為±0.05mL，認為是三角分布，則：

其產(chǎn)生的體積增量為50×0.00118×2=0.118mL，則：

查JJG 196-2006《常用玻璃量器》，單標線1mL的移液管(A級)允許誤差為±0.007mL，認為是三角分布，則：

其產(chǎn)生的體積增量為1×0.00118×2=0.00236mL，則：

=0.00344

(3)評定ur(c)

由式(5)得：

2.3.1.2評定對照品溶液峰面積A對的相對標準不確定度ur(A)

對照品溶液重復(fù)進樣6次，測量得到6個峰面積，分別為1528208、1527611、1527848、1527480、1527993、1528018，平均值為1527860，對照品溶液峰面積重復(fù)測量引入的相對標準不確定度為：

2.3.1.3評定供試品溶液峰面積A供的相對標準不確定度ur(A供)

每份樣品溶液分別進樣3次，得到3個峰面積，用極差法計算樣品溶液峰面積重復(fù)測量引入的相對標準不確定度，試樣1(可以其中任意1份樣品的測定結(jié)果計算)的峰面積分別為1396292、1392264、1394321，平均值為1394292，極差R=4028，取n=3時，極差系數(shù)C=1.69，則：

2.3.1.4評定供試品溶液的濃度c供的相對標準不確定度ur(c供)

供試品溶液濃度的不確定度由供試品稱樣量m供(0.15g)和50mL容量瓶(A級)、50mL容量瓶(A級)和5mL移液管(A級)引入引入，c供=m供/V供兩輸入量不相關(guān)，則：

(1)評定ur(m供)

供試品稱樣量m供(約0.15g)的不確定度由天平引入，分析同5.1.1.1，查天平檢定證書，量程為10mg≤m≤50g時，最大允差為±0.5mg，認為是矩形分布，則：

(2)評定ur(V供)

供試品稀釋時兩次用到50mL單標線容量瓶(A級)，5.1.1.2 評定ur(V50)由式(15)可知ur(V50)=0.00105查JJG 196-2006，容量為5mL的單標線移液管(A級)容量允許誤差為±0.015mL，認為是三角分布，則：

其產(chǎn)生的體積增量為5×0.00118×2=0.0118mL，則：

=0.00215

(3)評定ur(c供)

供試品平均片重(0.084g/片)的不確定度由天平引入，分析同5.1.1.1，查天平檢定證書，量程為10mg≤m≤50g時，最大允差為0.5mg，認為是矩形分布，則：

2.3.1.6評定u(X)

將各個分量代入式(4)得：

u(X)=ur(X)X=0.00670×97.8%=0.655%

2.3.2評定u(XR)

為評定u(XR)，取10份樣品進行重復(fù)性測定，測量數(shù)據(jù)見表2。

表2 X重復(fù)性測定

用貝塞爾公式計算標準差：

正常檢驗測量兩次取平均值，故：

2.4 合成標準不確定度的評定

由式(3)可得：

=0.67%

2.5 擴展不確定度的評定

按JJF 1059.1-2012的規(guī)定[13]，一般測量，可取包含因子k=2，則擴展不確定度為：

U=kuc(X')=2×0.67%=1.3%

2.6 測量報告結(jié)果

硝苯地平片HPLC法含量測量結(jié)果為：97.8±1.3%，k=2。

3 結(jié)論

由評定結(jié)果可知，測量結(jié)果的不確定度的主要來源是對照品和供試品的稱量、稀釋配制以及測量重復(fù)性引入的，其他分量引入的不確定度相對較小。因此在實際操作過程中，操作人員應(yīng)適當增加對照品的稱樣量，盡量減少稀釋步驟，轉(zhuǎn)移、稀釋時使用檢定級別較高的玻璃量器，選用精度符合要求并經(jīng)檢定合格的電子天平。人員要具備與檢驗工作相適應(yīng)的操作水平，以提高檢測結(jié)果的準確性。