胡婷婷，侯品品，魏子妤，葉 楓，莫小輝，Christos C. Zouboulis，鞠 強(qiáng)

尋常痤瘡是常見的毛囊皮脂腺單位慢性炎癥性疾病，炎癥貫穿其發(fā)生始終，是尋常痤瘡發(fā)病的啟動環(huán)節(jié)[1]。皮脂腺脂質(zhì)分泌增多是尋常痤瘡發(fā)生的前提條件[2]。近來發(fā)現(xiàn)，皮脂腺細(xì)胞能夠分泌白細(xì)胞介素(IL)-6等脂肪因子（adipokine），成為脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)研究有趣的細(xì)胞模型[3]。IL-6是尋常痤瘡病程中重要的炎性因子，但在皮脂腺細(xì)胞中的作用不明。IL-6通過與其特異性受體結(jié)合，實現(xiàn)其生物學(xué)功能[4]；其受體存在IL-6膜受體（IL-6R）及可溶性受體（sIL-6R）兩種模式。IL-6R介導(dǎo)的信號通路是經(jīng)典信號通路，而sIL-6R介導(dǎo)的為反式信號通路（trans-signaling）；在表達(dá)IL-6R的靶細(xì)胞上，IL-6首先與IL-6R結(jié)合[5]。筆者以體外培養(yǎng)的永生化SZ95人皮脂腺細(xì)胞作為細(xì)胞模型，檢測IL-6R的表達(dá)及IL-6對皮脂腺細(xì)胞脂質(zhì)合成的影響，力圖闡明IL-6在尋常痤瘡發(fā)生發(fā)展中的作用，為疾病的診療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

永生化SZ95人皮脂腺細(xì)胞由德國Zouboulis CC教授饋贈，Sebomed培養(yǎng)基（Biochrom公司），CCK8試劑盒（武漢博士德公司），酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（R＆D公司），重組人IL-6（Pepro Tech公司；PBS 溶解至 100 μg/ml），兔抗人IL-6R一抗（Abcam公司）、鼠抗人SREBP1一抗（Santa Cruz公司）、余一抗均購于Cell Signaling Technology公司。引物序列由上海生工生物技術(shù)有限公司代合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SZ95人皮脂腺細(xì)胞培養(yǎng)于Sebomed培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清、5 μg/L表皮生長因子、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和 1 mmol/L CaCl2。37℃含5% CO2的孵箱孵育，隔日換液。工作時新鮮配制含或不含各種濃度的IL-6的工作培養(yǎng)基。

1.2.2 ELISA法 24孔板接種細(xì)胞（每孔1×105個、6.5×104個、3×104個），復(fù)3孔，次日換液，分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h及96 h后收集上清。于收集上清前24 h更換培養(yǎng)基，上清液4℃ 3 000 r/min離心5 min，-20℃存放待檢測；Trizol和RIPA提取試劑提取相應(yīng)細(xì)胞總RNA及蛋白，-80℃凍存待檢測。按照IL-6 ELISA試劑盒說明書步驟進(jìn)行檢測，設(shè)定空白對照孔，450 nm酶標(biāo)儀檢測吸光度（A），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本濃度進(jìn)行比較。

1.2.3 CCK8細(xì)胞毒性及增殖實驗 96孔板接種細(xì)胞（每孔8 000個），24 h和48 h后添加不同濃度的IL-6，對照組設(shè)PBS對照及調(diào)零組，繼續(xù)孵育24 h后，棄上清后PBS清洗2遍，根據(jù)CCK8試劑盒操作說明進(jìn)行染色，酶標(biāo)儀在450 nm檢測A值，觀察細(xì)胞毒性及增殖效應(yīng)。

1.2.4 尼羅河紅脂質(zhì)染色法 黑色底透96孔板接種細(xì)胞（每孔104個），次日換液，80%～90%密度時添加不同濃度的IL-6及抑制劑，48 h后棄上清，PBS清洗2遍后進(jìn)行尼羅河紅染色，多功能酶標(biāo)儀定量檢測[6]。

1.2.5 實時熒光PCR（RT-PCR）法檢測 24孔板接種細(xì)胞（每孔105個），80%～90%密度時刺激，24 hTrizol提取試劑提取總RNA，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶獲得cDNA，檢測基因及引物序列見表1，設(shè)置GAPDH為對照。上機(jī)檢測后目的基因mRNA相對表達(dá)量采用ΔΔCT進(jìn)行計算[6]。

表1 RT-PCR檢測基因及引物序列

1.2.6 蛋白印跡法 6孔板接種細(xì)胞（每孔106個），80%～90%密度時刺激48 h，RIPA裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至 PVDF 膜上，4℃封閉過夜，加入一抗，4℃過夜，二抗室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光系統(tǒng) ECL試劑盒顯影定影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 IL-6及IL-6R在SZ95細(xì)胞中的表達(dá)

SZ95細(xì)胞表達(dá)IL-6及IL-6R，在細(xì)胞分裂進(jìn)程中逐漸上調(diào)。皮脂腺細(xì)胞體外以細(xì)胞分裂的方式增殖，根據(jù)培養(yǎng)時間長短來初步判定細(xì)胞分裂進(jìn)程，培養(yǎng)時間越長細(xì)胞分裂次數(shù)越多。IL-6R在蛋白及mRNA水平表達(dá)，4 d的mRNA水平是1 d的1.362倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-5.381，P＜0.05），蛋白水平變化不明顯（P＞0.05）；IL-6蛋白及mRNA水平隨細(xì)胞分裂進(jìn)程逐漸增多，4 d的表達(dá)量分別是1 d的2.122倍和3.013倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-11.149、-7.996，均P＜0.05）（圖1）。

圖1 IL-6及IL-6R在SZ95細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 IL-6對SZ95細(xì)胞增殖的影響

IL-6促進(jìn)SZ95細(xì)胞增殖。100 ng/ml IL-6培養(yǎng)后有晶體析出，選取較低濃度進(jìn)行統(tǒng)計分析。CCK8法示10 ng/ml IL-6作用24 h和48 h后，細(xì)胞活力百分率分別為120%和126%，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-8.402、-6.245，均P＜0.05）（圖 2）。

圖2 IL-6對SZ95細(xì)胞增殖的影響

2.3 IL-6對SZ95細(xì)胞中性脂質(zhì)合成的影響

IL-6刺激SZ95細(xì)胞中性脂質(zhì)合成。尼羅河紅染色法示10 ng/ml和1 ng/ml IL-6作用48 h后中性脂質(zhì)百分率分別為125%和116%，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-4.014、-2.897，P＜0.05）（圖3）。

圖3 IL-6對SZ95細(xì)胞中性脂質(zhì)合成的影響

2.4 IL-6對SZ95細(xì)胞脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

IL-6上調(diào)SZ95細(xì)胞脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)。RT-PCR法示脂質(zhì)相關(guān)基因PPARG、SREBP1、FASmRNA水平隨IL-6濃度依賴性上調(diào)（F=26.475、139.560、26.206，P＜0.05），均顯著高于對照組（t=-6.790、-22.012、-9.629，P＜0.05）。蛋白印跡法示10 ng/ml IL-6作用48 h后上調(diào)PPARG、FAS及SREBP1蛋白水平，灰度值結(jié)果與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-14.147、-7.962、-4.605，P＜ 0.05）（圖4，表2）。

圖4 IL-6對SZ95細(xì)胞脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

表2 IL-6對SZ95細(xì)胞脂質(zhì)合成相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響

3 討論

IL-6作為最易誘導(dǎo)的細(xì)胞因子之一，可由多種細(xì)胞分泌；生理狀態(tài)下呈低表達(dá)，在受到細(xì)菌、病毒、IL-1α及腫瘤壞死因子（TNF）-α等因子刺激后顯著分泌[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的SZ95細(xì)胞表達(dá)IL-6及IL-6R，在細(xì)胞分裂進(jìn)程中逐漸上調(diào)，符合IL-6的表達(dá)及分泌特性，提示IL-6能夠直接作用于SZ95細(xì)胞。近來發(fā)現(xiàn)，IL-6參與調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞增殖與分化，介導(dǎo)皮膚免疫防御、腫瘤形成、炎癥反應(yīng)及自身免疫性疾病的發(fā)生[8,9]。本研究發(fā)現(xiàn)，體外IL-6能夠刺激SZ95細(xì)胞脂質(zhì)合成，提示IL-6還可能通過調(diào)節(jié)皮脂腺細(xì)胞的生物學(xué)功能參與尋常痤瘡等相關(guān)疾病的發(fā)生。

脂質(zhì)合成是皮脂腺細(xì)胞分化的終末指標(biāo)，瘦素、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）、胰島素和TNF-α等細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)其脂質(zhì)合成，成為尋常痤瘡發(fā)生的重要致病因子[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-6促進(jìn)SZ95細(xì)胞中性脂質(zhì)合成，上調(diào)脂質(zhì)合成相關(guān)基因PPARG、FAS及SREBP1的表達(dá)，提示IL-6能夠促進(jìn)皮脂腺細(xì)胞的脂質(zhì)合成；與胰島素、IGF-1及TNF-α促皮脂腺細(xì)胞脂質(zhì)合成效應(yīng)一致[10,12]。然而，目前肝臟及脂肪細(xì)胞中，IL-6與脂質(zhì)代謝的關(guān)系存在爭議，IL-6通過不同受體發(fā)揮的促炎及抗炎效應(yīng)，通過下丘腦等中樞神經(jīng)系統(tǒng)參與調(diào)控瘦素、胰島素抵抗效應(yīng)被認(rèn)為是可能機(jī)制[13,14]。鑒于脂質(zhì)代謝包含合成及分解進(jìn)程，而本文僅檢測中性脂質(zhì)合成總量及合成代謝的部分關(guān)鍵基因，無法完整闡述皮脂腺細(xì)胞中脂質(zhì)代謝的方式。后續(xù)將針對脂質(zhì)成分及脂質(zhì)分解代謝相關(guān)基因檢測，結(jié)合IL-6敲除的皮脂腺細(xì)胞或動物模型進(jìn)一步明確IL-6在皮脂腺細(xì)胞脂質(zhì)代謝中的作用。

炎癥貫穿尋常痤瘡發(fā)生的始終，痤瘡丙酸桿菌（P.acnes）激活Toll樣受體2（TLR2）分泌IL-1α介導(dǎo)毛囊皮脂腺導(dǎo)管角化是尋常痤瘡發(fā)生的啟動因素[1,16]。尋常痤瘡患者血清及皮損中IL-6表達(dá)增加[15]；IL-6基因啟動子多態(tài)性與尋常痤瘡發(fā)病相關(guān)[17]；皮脂腺細(xì)胞分泌的IL-6能通過誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化，參與尋常痤瘡早期發(fā)生[18]。離體組織模型中，IL-6作用3 d上調(diào)皮脂腺漏斗部角質(zhì)形成細(xì)胞中細(xì)胞間黏附分子-1表達(dá)，IL-1α則無此效應(yīng)，提示盡管IL-1α作用7 d能介導(dǎo)漏斗部角質(zhì)形成細(xì)胞過度角化而誘導(dǎo)粉刺形成，IL-6似乎發(fā)揮了更早的促炎效應(yīng)而參與尋常痤瘡的發(fā)生[1]。在人角質(zhì)形成細(xì)胞中IL-6是IL-1α的下游靶因子，研究皮脂腺細(xì)胞中IL-6與IL-1α的關(guān)系更有利于進(jìn)一步揭示尋常痤瘡早期發(fā)病機(jī)制，其相關(guān)實驗正在進(jìn)行中。

綜上所述，本研究明確了SZ95人皮脂腺細(xì)胞中IL-6R的表達(dá)，體外證實了IL-6促進(jìn)細(xì)胞脂質(zhì)合成，從基礎(chǔ)層面解釋了皮脂腺細(xì)胞中炎性效應(yīng)與脂質(zhì)合成的密切關(guān)系，進(jìn)一步明確了炎癥效應(yīng)及脂質(zhì)分泌在誘導(dǎo)尋常痤瘡發(fā)生中的作用機(jī)制?？紤]到炎性因子眾多，研究相關(guān)炎性因子的相互作用以及對皮脂腺細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，對進(jìn)一步揭示尋常痤瘡早期發(fā)病機(jī)制意義重大。