王曉兵　龔志婷　姜樂　馬文豪　賀爾姝　鄭曉燁　張本斯　張麗梅

摘要：目的：構(gòu)建攜帶MC1R基因的重組腺相關(guān)病毒并探究小鼠海馬齒狀回中過表達(dá)MC1R基因?qū)π∈箝L期記憶的影響。方法：獲取小鼠目的基因MC1R。使用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII雙酶切AAV載體質(zhì)粒pAAV-CaMKIIα-eGFP-Dnmt3a及目的基因，使用T4DNAligase進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化stbl3感受態(tài)細(xì)胞并篩選陽性克隆pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R，并進(jìn)行測序驗證。將構(gòu)建的pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R、PAAV-DJ/8、pHelper質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝及純化并利用Q-PCR檢測病毒滴度。純化后的病毒通過立體定位注射到小鼠海馬齒狀回中，表達(dá)14天以上后，驗證該病毒是否能夠提高小鼠海馬區(qū)的MC1R基因表達(dá)，并檢測小鼠在曠場實驗及條件性恐懼實驗中的行為學(xué)改變。結(jié)果：rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R過表達(dá)病毒構(gòu)建成功，滴度約為1.1*1010，立體定位注射到小鼠海馬齒狀回中至少14天后小鼠海馬齒轉(zhuǎn)回中能表達(dá)綠色熒光蛋白，并能顯著提高小鼠海馬中MC1R基因的表達(dá)。進(jìn)一步的，過表達(dá)MC1R基因?qū)π∈髸鐖鰧嶒炛械淖园l(fā)活動、焦慮狀態(tài)均無影響，但顯著提高條件性恐懼實驗中的僵立水平。結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了重組腺相關(guān)病毒rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R，通過立體定位注射，該病毒顯著提高小鼠海馬齒狀回中MC1R基因的表達(dá)，并增強(qiáng)小鼠的長期記憶。我們的結(jié)果說明MC1R基因可能是一個記憶損傷類疾病如阿爾茲海默癥的一個潛在治療靶點。

關(guān)鍵詞：MC1R;腺相關(guān)病毒;海馬齒狀回;

【中圖分類號】G644.5???????????? 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A???????????? 【文章編號】2107-2306（2021）12--03

前言：黑素皮質(zhì)素1受體（MC1R）是一種環(huán)腺苷單磷酸刺激g蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）[1-4]，同時是MSH（α、β、γ）和ATCH的受體[1，2，5-7]，調(diào)節(jié)黑色素的形成，通過控制cAMP信號從而影響黑色素細(xì)胞，通過黑色素合成途徑調(diào)節(jié)皮膚生理。研究發(fā)現(xiàn)MC1R基因的改變與阿爾茲海默癥、帕金森病有密切的相關(guān)性，最新研究表明，激活MC1R在不同的通路中可以減輕IHC所致的神經(jīng)炎癥、在自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用、以及減弱蛛網(wǎng)膜下腔出血的癥狀。WeilinXu等人發(fā)現(xiàn)，在IHC后的小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、表皮細(xì)胞中均有表達(dá)，并且通過激活MC1R可以減少小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量。以上實驗均表明，黑素皮質(zhì)素-1受體（MC1R）不僅與神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，并且MC1R的激活在幾種神經(jīng)疾病中均有明顯的抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用。Genecard數(shù)據(jù)庫中表明MC1R在神經(jīng)系統(tǒng)中尤其是大腦中的表達(dá)水平較高，但是在大腦中明確的生理功能以及作用機(jī)制并不清楚。由于以上眾多的研究已經(jīng)證明MC1R在大腦、脊髓中都有發(fā)揮作用，本研究采用腺相關(guān)病毒PAAV，構(gòu)建含有小鼠MC1R基因的腺相關(guān)病毒載體（rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R），通過感染小鼠大腦海馬齒狀回區(qū)域，驗證MC1R基因的表達(dá)效果，為MC1R相關(guān)疾病，可能是包括阿爾茲海默癥在內(nèi)的長期記憶損傷等相關(guān)疾病提供治療靶點。

一、材料與方法

（一）材料

大腸桿菌DH5α、Stbl3感受態(tài)購自康體生命公司;重組腺病毒構(gòu)建系統(tǒng)（DJ/8包裝系統(tǒng)）購自CELLBIOLABs公司（美國）、HEK293T細(xì)胞由中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院李紅昌課題組惠贈;EcoRI、HindIII酶，T4DNA連接酶，TaqDNA聚合酶、DMEM/HighGlucose培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、青霉素、鏈霉素等購自ThermoFisherScientific公司（美國）;RNA提取試劑盒購自生工;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自promega公司（美國）;質(zhì)粒DNA提取試劑盒購、AAV純化試劑盒購自biomiga公司（美國）;小鼠腦立體定位儀購自瑞沃德公司;冰凍切片機(jī)購自ThermoFisherScientific公司（美國）;曠場、條件恐懼、軟件及硬件均購自上海欣軟公司。

（二）實驗方法

1.目的基因的獲取

腹腔注射水合氯醛麻醉C57小鼠后，灌注取腦，使用trizol提取的方法快速抽提總RNA，按照promega公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書使用所提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

2.重組腺相關(guān)病毒（rAAV）表達(dá)載體pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R的構(gòu)建

PCR純化產(chǎn)物和pAAV-CaMKIIα-eGFP-Dnmt3a（自己構(gòu)建）使用EcoRI和HindIII在37℃水浴中進(jìn)行雙酶切，pAAV-CaMKIIα-eGFP-Dnmt3a所得酶切大片段，和PCR酶切所得目的基因在T4DNA連接酶的作用下連接22℃、2小時，所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化stbl3感受態(tài)（連接產(chǎn)物），冰浴后放入無抗LB培養(yǎng)基復(fù)蘇，復(fù)蘇完成后，取適量已轉(zhuǎn)化好的的感受態(tài)細(xì)胞涂抹于Amp+藥液的LB平板上37℃培養(yǎng)過夜，24小時后挑選陽性單克隆的單個菌落，接種于含Amp+藥液的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定大小正確的質(zhì)粒樣品送到華大基因進(jìn)行測序。

3.pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R腺相關(guān)病毒的包裝、純化和滴度測定

首先，將攜帶目的MC1R基因的重組質(zhì)粒pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R、pAAV-DJ/8、pHelper，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)Stbl3，使用biomiga的質(zhì)粒大提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取后用于病毒包裝，使用高效轉(zhuǎn)染試劑盒，將大提所得質(zhì)粒pAAV-DJ/8，pHelper，以及pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R按照1：1：1.5的比例轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞接種于10cm培養(yǎng)皿中，4-6小時后更換新鮮的完全培養(yǎng)基，48小時后，轉(zhuǎn)染72小時后收細(xì)胞，按照biomigaAAV純化試劑盒的方法純化出腺相關(guān)病毒rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R，采用熒光定量PCR（qPCR）的方法檢測所得病毒溶液中包含目的片段的拷貝數(shù)，進(jìn)而推知單位體積內(nèi)有效病毒顆粒數(shù)，得出滴度。

qPCR引物序列如下：

AAVtest-F：5’-CGCAGCGTCACACAGAAG-3’

AAVtest-R：5’-GCAGGGTTGACAATGGAGAG-3’

4.rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R功能鑒定

取C57/BL6小鼠放入麻醉箱用異氟烷麻醉，麻醉后，將小鼠放入腦立體定位儀的操作臺上，用耳桿固定，后進(jìn)行調(diào)平，用5微升量程33G針頭的微量注射器（漢密爾頓）注射病毒，采用微量注射泵（上海欣軟）控制注射速度。使用以下坐標(biāo)將病毒注射到海馬的dDG中，Bregma：AP=-2.1毫米;ML=±1.4毫米;DV=-1.9毫米。注射速度為150nl/min，rAAV-MC1R及AAV-GFP均為0.8～1.0μl，注射針保持在注射位置至少180秒，以允許病毒充分?jǐn)U散。病毒表達(dá)至少14天后，進(jìn)行行為學(xué)實驗。

5.條件恐懼實驗

實驗開始前，所有小鼠從飼養(yǎng)間移出至行為學(xué)實驗室，在實驗室的適應(yīng)間內(nèi)至少放置1hr，實驗開始后小鼠沒有適應(yīng)時間直接電擊2s，間隔2min后再給與2s的電刺激，刺激結(jié)束1min后取出小鼠。一天后recall，放入同樣的環(huán)境記錄freezing值，實驗最終將統(tǒng)計小鼠freezing時間占總時間的百分比。

二、結(jié)果

（一）目的基因的獲取

結(jié)合primerblast程序設(shè)計引物，

上游引物：5-gaattcatgtccactcaggagccccagaagagtc-3’，

下游引物：5’-aagctttcaccaggagcacagcagcacctcc-3’，通過上海生工生物公司合成后，使用所提取的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的基因，得到940bp左右的條帶（見圖1）

（二）線性化載體pAAV-CaMKIIα-eGFP-dnmt3a的雙酶切

pAAV-CaMKIIα-eGFP-Dnmt3a（自己構(gòu)建PMID29572461）使用EcoRI和HindIII在37℃水浴中進(jìn)行雙酶切，得到線性化質(zhì)粒pAAV-CaMKIIα-eGFP（如圖2）

（三）質(zhì)粒酶切后鑒定結(jié)果

我們預(yù)選了5個候選質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，其中只有3號質(zhì)粒可以切出目的條帶，進(jìn)一步對3號質(zhì)粒酶切結(jié)果進(jìn)行電泳，確定條帶大小正確后送華大基因測序（如圖3、4）

（四）pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R載體的構(gòu)建

DNAMAN分析pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R質(zhì)粒中的MC1R基因序列與NCBI中提供的MC1R序列一致，（見圖5），表明pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R載體構(gòu)建成功。

（五）pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R包裝、擴(kuò)增及滴度測定

將制備的重組質(zhì)粒pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，換液48小時后進(jìn)行收病毒，取病毒濃縮液提取病毒DNA，進(jìn)行Qpcr檢測病毒滴度。

pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R滴度為1.1*1010（見圖6、7）

（六）rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R功能鑒定

將構(gòu)建成功的rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R感染小鼠大腦海馬齒狀回，表達(dá)至少14天后，提取總RNA，Qpcr驗證MC1R過表達(dá)成功，結(jié)果見圖9、10（UnpairedttestPvalue<0.0001t，dft=7.831df=18）

小鼠大腦海馬齒狀回小鼠海馬齒狀回內(nèi)的過表達(dá)結(jié)果

（七）條件恐懼結(jié)果

在條件恐懼實驗中我們通過測試小鼠freezing值發(fā)現(xiàn)rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R小鼠與對照組小鼠相比，如圖8所示freezing值（n=6，6;Unpairedt-test，p=0.05）如圖8所示（n=6，6;），說明rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R小鼠記憶增強(qiáng)。

討論：MC1R基因此前是作為控制動物毛色的基因存在，主要通過cAMP信號影響黑色素細(xì)胞的功能。自2001年來，MC1R在黑色素瘤、細(xì)胞生長和死亡、P53信號通路、DNA復(fù)制方面均有影響和作用。在神經(jīng)系統(tǒng)中，腦出血后，通過NDP-MSH激活MC1RCREB/Nr4a1/NF-κB通路，可以減輕腦出血所致的神經(jīng)炎癥，以及血腦屏障的損傷。黑皮質(zhì)素1受體的激活通過大鼠AMPK/TBK1/NF-κB通路抑制神經(jīng)炎癥，減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血等早期腦損傷，。黑皮質(zhì)素1受體通過AMPK/SIRT1/PGC-1α通路控制線粒體代謝減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血后的早期腦損傷。用BMS-470539激活MC1R通過cAMP/PKA/Nurr1通路減輕大鼠新生兒缺氧缺血性腦損傷后的神經(jīng)炎癥。因此，在此基礎(chǔ)上，我們提出MC1R可能會成為神經(jīng)退行性變疾病領(lǐng)域新的治療靶點。

近年來，MC1R基因被發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用越來越廣泛，并且分子醫(yī)學(xué)已經(jīng)成為了近年來研究的熱點，相對而言，重組腺相關(guān)病毒（rAAV）載體具有非致病性、廣泛的組織嗜性和長期轉(zhuǎn)基因表達(dá)等特點，被認(rèn)為是最有發(fā)展前景的基因治療載體。本文借助重組腺相關(guān)病毒為介導(dǎo)，成功構(gòu)建了rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R、以及rAAV-CaMKIIα-eGFP對照病毒，并在小鼠海馬齒狀回特異性表達(dá)MC1R基因，不僅能應(yīng)用于科學(xué)研究，在將來的基因治療中也有潛力。

在rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R構(gòu)建過程中，我們首先將小鼠MC1R基因定向克隆至pAAV-CaMKIIα-eGFP載體形成pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R重組質(zhì)粒，經(jīng)測序后轉(zhuǎn)染至293t細(xì)胞，經(jīng)擴(kuò)增收毒、純化及濃縮后測定病毒滴度，感染小鼠大腦海馬齒狀回進(jìn)行rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R功能鑒定，Qpcr驗證MC1R過表達(dá)成功，說明rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R構(gòu)建成功。后期我們通過曠場進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)注射腺相關(guān)病毒的小鼠并沒有表現(xiàn)出活動能力及探索能力的障礙以及出現(xiàn)焦慮樣行為，我們認(rèn)為病毒的注射并不會影響小鼠的探索、運(yùn)動能力以及小鼠焦慮樣行為;小鼠進(jìn)行contextualfear條件恐懼實驗時，表現(xiàn)出了明顯的記憶提高，此實驗結(jié)果說明，MC1R通過rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R病毒載體，在大腦海馬齒狀回的高表達(dá)可能會成為阿爾茲海默癥等神經(jīng)退行性疾病的治療靶點。

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基金項目：國家自然科學(xué)基金項目：《小鼠海馬背側(cè)齒狀回中的Dnmt3a表達(dá)調(diào)控恐懼記憶更新的機(jī)制探究》;項目編號：（No.81960255）;云南省基礎(chǔ)研究專項云南省基礎(chǔ)研究項目-青年項目《Dnmt3a在早期應(yīng)激所致抑郁中的作用和機(jī)制研究》;項目編號：No.202001AU070051;大理大學(xué)博士科研啟動費項目，《小鼠海馬齒狀回在恐懼記憶更新中的作用研究》;項目編號：No.KYBS2018008。

作者簡介：王曉兵（1994—），女，漢族，山東濟(jì)南市人，研究生，無職稱，單位：大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)專業(yè)，研究方向：神經(jīng)生物學(xué)