王倩 綜述 余昌胤 審校

遵義醫(yī)科大學(xué)，貴州 遵義 563000

神經(jīng)突觸參與了大腦信息的處理及傳輸，是神經(jīng)元細胞之間交換信息的重要紐帶。大腦中神經(jīng)元突觸損害可引發(fā)認知功能障礙等一系列神經(jīng)系統(tǒng)疾病。近年來發(fā)現(xiàn)MSCs外泌體由于其自身的性質(zhì)和特點作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在神經(jīng)細胞軸突再生和突觸重塑中發(fā)揮重要作用。

1 外泌體的概念

外泌體初次在成熟網(wǎng)織紅細胞中發(fā)現(xiàn)，被認為是細胞向外界排放廢物的載體。后續(xù)研究鑒定出外泌體中含有mRNA、miRNA、DNA、蛋白質(zhì)和信號復(fù)合物等物質(zhì)，并證實外泌體可被靶細胞攝取傳遞細胞信息并產(chǎn)生一系列生物學(xué)活性[1]。

1.1 外泌體的起源、結(jié)構(gòu) 外泌體來源于晚期胞內(nèi)體，是胞外囊泡的一種類型。作為囊泡運輸?shù)妮d體，外泌體的形成主要經(jīng)歷3個過程：首先形成早期內(nèi)涵體(early endosome)，隨后以內(nèi)生芽的方式形成囊泡小體(multivesicular bodies，MVBs)，最后部分MVBs與細胞膜融合釋放到胞外，形成大小均一的囊泡，即外泌體[2]。電鏡下，外泌體大小30～100 nm，呈雙凹圓盤狀或杯口狀，并能在細胞間相互運輸，介導(dǎo)相鄰細胞或全身范圍內(nèi)細胞之間的信息交換[3]。體內(nèi)多數(shù)細胞及神經(jīng)細胞均能分泌外泌體，且普遍存在于腦脊液、尿液、乳汁和血液等多種體液中。

1.2 外泌體的分子組成與生物功能 外泌體內(nèi)富含多種類型蛋白質(zhì)及脂質(zhì)，如蛋白膜轉(zhuǎn)運、融合蛋白、跨膜蛋白、熱休克蛋白以及脂質(zhì)蛋白等。其外層為脂質(zhì)雙分子結(jié)構(gòu)，富含多種脂類，可以保護其內(nèi)含物不被降解，從而維持外泌體的形態(tài)。外泌體還攜帶多種RNA，通過與細胞受體結(jié)合或與質(zhì)膜融合的方式作用于靶細胞并發(fā)揮其功能。STATELLO等[4]研究證實，外泌體RNA可以在受體細胞和調(diào)節(jié)基因中表達，從而發(fā)揮一定的生物效應(yīng)。

1.3 外泌體可通過血腦屏障 中樞神經(jīng)血管單元(neurovascular unit，NVU)由細胞外基質(zhì)、周細胞、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元組成，維持血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的功能。外泌體在NVU細胞間起著關(guān)鍵作用，以影響神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)血管生成和少突膠質(zhì)細胞發(fā)生，調(diào)節(jié)NVU中的細胞通信。外泌體能夠通過BBB從中樞神經(jīng)系統(tǒng)到外周或外周到中樞神經(jīng)系統(tǒng)并調(diào)節(jié)細胞信號傳導(dǎo)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)有兩種可能機制：被內(nèi)皮細胞攝取，通過細胞間的轉(zhuǎn)運最后轉(zhuǎn)移到大腦內(nèi)的受體細胞；或跨越內(nèi)皮細胞之間的細胞間連接，直接進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。LIU等[6]證實外泌體可將腦脊液中的miR-135a通過血腦屏障傳遞至外周血，在循環(huán)血液中發(fā)揮生物學(xué)作用。在大鼠脊髓損傷模型中，研究發(fā)現(xiàn)BMSCs外泌體也可以影響中樞系統(tǒng)周細胞的NFκB通路活性，減少VEGF分泌，從而穩(wěn)定血腦屏障，減輕神經(jīng)功能損害，改善預(yù)后[7]。

1.4 間充質(zhì)干細胞(MSC)源性外泌體 MSCs是一群具有自我更新、多向分化和免疫調(diào)節(jié)功能的成體干細胞群。由于其來源廣、再生能力強、多向分化能力及免疫抑制性，近年來廣泛應(yīng)用于多種疾病。目前，人們普遍傾向于間充質(zhì)干細胞通過旁分泌發(fā)揮其主要作用，可通過吞噬、胞膜融合、受體接觸等方式將內(nèi)容物釋放到細胞質(zhì)內(nèi)?？稍谠S多實驗中觀察到MSCs的旁分泌作用[8]。

MSCs源性外泌體是攜帶和傳遞分子到靶向細胞的理想載體，包括治療基因、藥物、酶或RNA[9]。同其他細胞類型的外泌體，MSCs源性外泌體也可運輸?shù)鞍踪|(zhì)和miRNA，參與細胞的信號傳導(dǎo)及周期調(diào)控。相比，MSCs具有更為廣泛的組織分化能力，可分化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元等；其來源廣泛，可以從骨髓、脂肪組織、牙髓及妊娠組織(胎盤、羊水、臍帶膠質(zhì)、臍血、絨毛膜)等獲?。灰蚱淙狈LA-DR的表達，其免疫原性明顯低于其他細胞類型；且MSCs源性外泌體可通過血腦屏障，參與生物活性分子的傳遞。目前研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞分泌外泌體能力最強，并且可通過Fas/Fap-1/Cav-1復(fù)合物來調(diào)控間充質(zhì)干細胞外泌體的分泌，加速傷口創(chuàng)面愈合[10]。還可以調(diào)節(jié)多種細胞參與從而發(fā)揮其免疫作用，抑制炎癥反應(yīng)，促進組織修復(fù)，以維持組織穩(wěn)態(tài)和平衡。

此外，MSCs外泌體的治療效果已在多種疾病中得到證實。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，研究證明MSCs在體外特定條件誘導(dǎo)下或機體受損后可以分化為雪旺氏樣細胞，與其他細胞來源外泌體相比，MSCs源性外泌體更能介導(dǎo)受損神經(jīng)元組織的修復(fù)，促進細胞間的信息傳遞和抗原呈遞、調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答[11-12]。在一項缺血模型研究中，骨髓來源MSCs的外泌體通過抑制促凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)蛋白、腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-1β的表達，增強抗凋亡蛋白的表達，改善神經(jīng)行為表現(xiàn)，并通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞極化而表現(xiàn)出神經(jīng)保護作用[13]。RUPPERT等[14]還報道了MSCs源性外泌體可以減輕脊髓組織中星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的神經(jīng)炎癥并改善功能恢復(fù)。這些結(jié)果表明，MSCs源性外泌體可以改善神經(jīng)系統(tǒng)疾病癥狀。

2 MSCs外泌體介導(dǎo)軸突再生與突觸重塑

神經(jīng)元不可再生，神經(jīng)突起(包括軸突和樹突)再生是神經(jīng)系統(tǒng)損傷后功能恢復(fù)的主要方式。神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞之間互相作用，協(xié)調(diào)軸突和髓鞘形成。神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞釋放的外泌體參與了這些過程，分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子以維持受損的神經(jīng)元存活并促進軸突生長。對間充質(zhì)干細胞分泌物刺激靶細胞進行研究，包括骨和軟骨再生、神經(jīng)疾病、肝臟損傷、急性腎臟損傷和心血管疾病等都證實間充質(zhì)干細胞所分泌的分子既可以直接激活靶細胞又能刺激臨近細胞分泌活性因子，并且在動物疾病模型中發(fā)揮神經(jīng)元保護、神經(jīng)元再生、神經(jīng)元形成、突觸可塑性等重要作用。此外，研究證實外泌體除含有遺傳物質(zhì)、多種蛋白質(zhì)外，還含有對軸突生長有著關(guān)鍵性作用的肌動蛋白、微管蛋白細胞等骨架蛋白[15]。

CHIVET等[16]發(fā)現(xiàn)，當中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損時，突觸離子型谷氨酸受體亞型N-甲基-D-天冬氨酸受體被激活，神經(jīng)細胞釋放的外泌體含有Synaptotagmin蛋白，作用于其他神經(jīng)元后可以調(diào)節(jié)軸突生長的逆行信號，且這些囊泡體優(yōu)先在突觸前部位結(jié)合，證實外泌體參與突觸功能的調(diào)節(jié)。此外，經(jīng)視黃酸受體β2(RARβ)激動劑處理的神經(jīng)元外泌體對神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞失活PTEN信號具有雙重作用，導(dǎo)致突觸生長增強，抑制星形膠質(zhì)細胞的增殖[17]。TANG等[18]研究證明外泌體可以通過PTEN-mTOR通路增強損傷神經(jīng)元軸突再生。從寡糖樹狀細胞瘤中提取的攜帶髓鞘相關(guān)蛋白的外泌體，有助于髓鞘化和維持神經(jīng)元的完整性[19]。因此，神經(jīng)元外泌體通過神經(jīng)元之間的突觸轉(zhuǎn)運及與細胞之間的聯(lián)系，介導(dǎo)突觸和軸突的可塑性。

2.1 MSCs外泌體與卒中后神經(jīng)細胞突觸重塑 腦卒中是影響人類健康的重大疾病，外泌體在其病理生理過程中傳遞細胞物質(zhì)，調(diào)節(jié)卒中后細胞信號傳導(dǎo)。成熟的少突膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的髓鞘蛋白與髓鞘的正常形態(tài)和功能密切相關(guān)。因此，腦損傷后少突膠質(zhì)細胞的分化成熟以及軸突的生長對神經(jīng)功能的修復(fù)起著重要作用。研究證實外泌體可以促進軸突再生以及少突膠質(zhì)細胞的增殖、分化，并促進軸突的髓鞘形成，改善腦損傷后的神經(jīng)功能。在大鼠模型中，富含miR-219的外泌體刺激少突膠質(zhì)細胞前體分化成髓鞘細胞，并促進髓鞘在CNS中的形成[20]。研究證實腦卒中時將顯著下調(diào)腦中miR-133b，通過使用過表達miR-133b的MSCs外泌體，可以促進短暫性腦缺血模型小鼠星形膠質(zhì)細胞外泌體的二次釋放，顯著增加大腦動脈閉塞小鼠大腦神經(jīng)突分支數(shù)量和神經(jīng)元的長度[21]。ZHANG等[22]發(fā)現(xiàn)來源于間充質(zhì)干細胞的外泌體促進神經(jīng)細胞軸突的生長，可能與miRNA-17-92有關(guān)：他們轉(zhuǎn)染miRNA-17-92至MSC后發(fā)現(xiàn)，外泌體中高表達的miRNA-17-92可進一步促進軸突生長。

同樣，也有研究報道m(xù)iRNA-17-92可靶向作用于信號通路蛋白AKT、mTOR、GSK-3β，促進其磷酸化，激活相應(yīng)的信號通路，促進軸突重建。CHEN等[23]研究結(jié)果顯示，脂肪MSCs外泌體內(nèi)含有的神經(jīng)因子能促進受損神經(jīng)元軸突再生。這些研究表明，MSCs外泌體通過神經(jīng)元之間的突觸轉(zhuǎn)移和與星形膠質(zhì)細胞的通信來介導(dǎo)腦卒中神經(jīng)細胞軸突和突觸重塑。

2.2 MSCs源性外泌體與阿爾茲海默病神經(jīng)細胞突觸重塑 阿爾茨海默病(AD)是一種高致殘率和普遍流行的神經(jīng)退行性疾病。其病理特征主要是β淀粉樣蛋白(amyloidβ，Aβ)形成淀粉樣斑塊和tau蛋白高度磷酸化形成神經(jīng)纖維纏結(jié)。淀粉樣β肽的可溶性寡聚體(AβOs)被認為是參與早期神經(jīng)元氧化應(yīng)激和突觸損傷的神經(jīng)毒素，最終導(dǎo)致AD的神經(jīng)變性和記憶障礙。MARIANA等[24]實驗結(jié)果顯示，MSCs及其外泌體能夠保護神經(jīng)元免受AβOs引起的氧化應(yīng)激和突觸損傷，從而保護海馬區(qū)神經(jīng)元和突觸，減少腦內(nèi)Aβ斑塊沉積和水平。ZHAO等[25]研究表明，通過MSC傳遞外源蛋白可以調(diào)節(jié)APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠小膠質(zhì)細胞功能，增強海馬神經(jīng)發(fā)生，改善突觸相關(guān)蛋白表達，顯著減輕學(xué)習(xí)記憶障礙。ZALDIVAR等[26]研究還評估了MSCs外泌體和MSCs在側(cè)腦室室下區(qū)促進神經(jīng)發(fā)生的作用，與AD組相比，用MSCs和MSCs外泌體處理的小鼠增加了SVA唾液酸神經(jīng)細胞黏附分子(PSA-NCAM)和雙皮質(zhì)素/微管相關(guān)蛋白(DCX)陽性細胞的數(shù)量，其中PSA-NCAM和DCX被廣泛應(yīng)用于新生未成熟神經(jīng)元和神經(jīng)元前體的鑒定，評價神經(jīng)發(fā)生，表明MSCs和MSC外泌體都可以有效地促進阿爾茨海默病模型腦室下區(qū)的神經(jīng)發(fā)生。

2.3 MSCs源性外泌體與周圍神經(jīng)損傷后細胞突觸重塑 MSC源性外泌體作為細胞旁分泌產(chǎn)物，可能在周圍神經(jīng)損傷(PNI)后的恢復(fù)中起主要作用。VERRILLI等[27]報道了不同來源的MSC外泌體，包括人月經(jīng)間充質(zhì)干細胞(MenSCs)和骨髓間充質(zhì)干細胞(BMMSCs)，都可以促進背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和皮層神經(jīng)元的突起生長。另一項研究表明，人脂肪干細胞源性外泌體(ASC-exos)在被雪旺細胞(SCs)內(nèi)化后，通過優(yōu)化SCs功能，減少SCs凋亡、減輕自噬作用，體外上調(diào)相應(yīng)的基因促進周圍神經(jīng)軸突再生[28]。同時，ZHANG等[29]證明大鼠注射骨髓干細胞源性外泌體(BMSC-Exosome)可激活ERK1/2、STAT3 和CREB信號通路蛋白，這些信號通路蛋白參與神經(jīng)損傷后的神經(jīng)元生長和軸突再生。在大鼠脊髓損傷模型中，損傷區(qū)域NF200染色少于遠端區(qū)域。注射BMSC-外泌體組損傷區(qū)NF200染色減少遠低于對照組，Western blot也顯示BMSC-外泌體組NF200的表達水平明顯高于對照組，表明BMSC-外泌體促進外傷性脊髓損傷后的軸突再生[30]。此外，特異性表達的miRNA參與MSC的增殖和表型轉(zhuǎn)換、神經(jīng)發(fā)生、軸突外生長和巨噬細胞遷移。例如，特異性miRNA的過表達(miR-23a，miR-200，miR-133b，miR-17-92簇)可以促進軸突基因的發(fā)生和髓鞘化[31-34]。同時最近的研究表明，MSCs源性外泌體分泌的miRNA-126也可以保護脊髓損傷大鼠神經(jīng)元，從而介導(dǎo)神經(jīng)的可塑性，改善損傷后神經(jīng)的恢復(fù)[35]。MSCs源性外泌體可能通過傳遞外泌體miRNA來靶向神經(jīng)源生態(tài)位中的神經(jīng)細胞，從而促進突起的生長。除了傳遞遺傳成分外，MSCs外泌體還含有許多神經(jīng)營養(yǎng)因子，在軸突再生中也起著關(guān)鍵作用。因此，MSCs外泌體中與神經(jīng)修復(fù)相關(guān)的生物活性分子的存在提供了調(diào)節(jié)去神經(jīng)肌肉萎縮、神經(jīng)存活和軸突生長恢復(fù)的可能性。

3 外泌體治療應(yīng)用的當前挑戰(zhàn)

由于人群的異質(zhì)性和神經(jīng)系統(tǒng)疾病機制的復(fù)雜性，只有少數(shù)藥物在臨床試驗中取得了成功，適合治療患者。外源性給藥具有嚴重副作用的風(fēng)險，如惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤產(chǎn)生或微血管阻塞[36]。基于MSC細胞治療的治療效果可以通過分泌可溶性因子，如外泌體等來介導(dǎo)。LAURA等[37]證明MSCs外泌體的治療效果與MSCs一致，并且通過增強腦修復(fù)機制和發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用來治療神經(jīng)疾病。MSCs外泌體的低免疫原性、低毒性、生物降解性和跨越血腦屏障的能力是作為外源性疾病治療的優(yōu)點。盡管如此，一些問題必須解決，才能在臨床試驗中應(yīng)用MSCs外泌體：一是開發(fā)技術(shù)，以低成本大規(guī)模獲得外泌體；二是需要標準的分離技術(shù)來獲得高純度的外泌體；三是如何通過外泌體遞送來提高靶向藥物治療的準確性。

4 展望

綜上，外泌體在神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理和生理過程及治療中發(fā)揮重要作用。間充質(zhì)干細胞源性外泌體可以通過調(diào)節(jié)基因、蛋白質(zhì)和RNA在靶細胞和組織中的表達來誘導(dǎo)神經(jīng)細胞突觸再生和重塑發(fā)揮神經(jīng)保護作用。在不同分泌外泌體的細胞類型中，MSCs外泌體較其他細胞來源外泌體介導(dǎo)神經(jīng)細胞突觸再生功能在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用潛力受到了廣泛關(guān)注，其大致具有以下幾個優(yōu)點：免疫原性，降低了免疫細胞對受體細胞的識別及吞噬；可自由通過血腦屏障；脂質(zhì)雙分子層可以運輸和保護腔內(nèi)的物質(zhì)免受細胞外環(huán)境的破壞；外泌體治療為無細胞治療，降低了MSC移植所引起的致瘤及栓塞的風(fēng)險。但是，MSCs外泌體的研究還面臨諸多挑戰(zhàn)，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷和治療方面的研究仍任重道遠，需要進一步探尋其臨床治療的研究策略。