鄭國洪， 孫 斌， 王晶晶， 楊正明

（1浙江省舟山市中醫(yī)院急診骨傷科，浙江舟山316000；2浙江省舟山市中醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科，浙江舟山316000；3寧波龍賽醫(yī)院骨傷科，浙江寧波315299；4浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院骨科，浙江杭州310009）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自身免疫性疾病，成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）在 RA 發(fā)病中起重要作用，F(xiàn)LS 的過度增殖可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，造成關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞；抑制滑膜成纖維樣細(xì)胞的異常增殖是治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的重要策略［1-2］。研究表明中醫(yī)藥在治療RA中具有良好效果［3］。中藥杜仲為杜仲科植物杜仲的樹皮，是我國特有的一種名貴中藥材，其含有多種活性成分，具有保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨、抗骨性關(guān)節(jié)炎以及抗膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜炎病變的藥理作用［4-5］。研究報道杜仲提取物通過調(diào)節(jié)體內(nèi)和體外的炎癥，滑膜細(xì)胞增殖和破骨細(xì)胞形成來改善關(guān)節(jié)炎［6］。杜仲的樹皮，葉子和雄花提取物通過抑制炎癥減輕骨質(zhì)破壞［7］。杜仲皮水提取物可能通過激活PI3K/Akt-eNOS 信號通路治療大鼠急性骨髓炎［8］。然而杜仲皮水提取物對RA-FLS生長與凋亡的影響及機制尚不清楚。

研究報道脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）處理的軟骨細(xì)胞中環(huán)狀RNA-FADS2（circular RNAFADS2，circFADS2）高表達(dá)，沉默circFADS2降低了LPS 處理的軟骨細(xì)胞增殖，提高了細(xì)胞凋亡水平［9］。生物學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)circFADS2 與微小RNA-491-5p（microRNA-491-5p，miR-491-5p）有結(jié)合位點。miR-491-5p 下調(diào)可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，并抑制細(xì)胞凋亡，減緩動脈粥樣硬化進(jìn)程［10］。然而circFADS2和miR-491-5p對RA-FLS 增殖與凋亡的影響及其關(guān)系尚不清楚。本實驗旨在研究杜仲皮水提取物（water extract ofEucommiaecortex，WEEC）對RA-FLS 生長與凋亡的影響及機制是否與調(diào)節(jié)circ-FADS2、miR-491-5p有關(guān)。

材料和方法

1 細(xì)胞與試劑材料

RA-FLS 購自 Cell Applications；DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；CCK-8 試劑盒和凋亡檢測試劑盒購自上海吉至生化科技有限公司；RIPA 蛋白裂解液購自上海碧云天生物公司；總RNA 提取試劑盒購自艾美捷科技有限公司；螢光定量PCR 試劑盒購自上?？泼羯锟萍加邢薰?；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自GeneCopoeia；杜仲皮購自亳州市安寶堂生物科技有限公司。

2 杜仲皮水提取物的制備

將杜仲皮粉碎后過60 目篩網(wǎng)，稱取40 g 粉末置于1 000 mL 的無菌蒸餾水中煮沸4 h，用300 目篩網(wǎng)過濾，收集濾液，水浴濃縮蒸發(fā)干液體，然后加蒸餾水配制成濃度為3 g/L的WEEC。

3 實驗方法

3.1 細(xì)胞處理與分組 RA-FLS 用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，分別用0.1、0.3、0.9 和 2.7 g/L 的 WEEC 處理，作為不同濃度WEEC 組，以常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞作為正常對照（normol control，NC）組；將pcDNA、pcDNA-circFADS2、anti-miR-NC 和 anti-miR-491-5p 轉(zhuǎn) 染 至 RA-FLS 后 用0.9 g/L 的 WEEC 處理，記為 pcDNA+WEEC 組、pcDNA-circFADS2+WEEC組、anti-miR-NC+WEEC組、anti-miR-491-5p+WEEC 組；將 pcDNA-circFADS2 分別與 miR-NC 和 miR-491-5p 共轉(zhuǎn)染至 RA-FLS，而后用0.9 g/L 的 WEEC 處 理 ，記 為 miR-NC+pcDNA-circ-FADS2+WEEC 組 、miR-491-5p+pcDNA-circFADS2+WEEC組。

3.2 CCK-8 法檢測細(xì)胞活力 各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h，每孔中加入10 μL CCK-8試劑，孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞450 nm 波長處的吸光度（A）值，以對照組細(xì)胞活力為100%，換算為細(xì)胞活力。

3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS 漂洗2 次，用結(jié)合緩沖液重懸，然后加入Annexin V-FITC 和PI 溶液一起避光孵育15 min；用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率。

3.4 Western blot法檢測蛋白水平 收集各組細(xì)胞，加入RIPA 裂解液提取總蛋白，將裂解物經(jīng)10%的SDS-PAGE 分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，室溫下用5%脫脂牛奶封閉膜1 h，然后在4 ℃下與Ⅰ抗孵育過夜，室溫與Ⅱ抗孵育2 h，曝光顯影后用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參照計算蛋白的相對水平。

3.5 RT-qPCR 檢測 circFADS2 和 miR-491-5p 的表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞，提取總RNA，取1 μg RNA制備cDNA，然后進(jìn)行qPCR，循環(huán)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40 個循環(huán)；72 ℃ 5 min；以 GAPDH 和 U6 為內(nèi)參照，用 2-△△Ct法計算相對表達(dá)量。circFADS2 的上游引物序列為5′-CATGGGGAAGGGAGGGAACC-3′，下游引物序列為5′-GGGTGCTGGATGG ACCATTT-3′；GAPDH 的上游引物序列為 5′-GATATTGTTGCCATCAATGAC-3′，下游 引 物 序 列 為 5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′；miR-491-5p 的 上 游 引 物 序 列 為 5′-GGAGTGGGGAACCCTTCC-3′，下 游 引 物 序 列 為 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6 的 上 游 引 物 序 列 為 5′-CTTCGGCAGCACATATAC-3′，下游引物序列為 5′-GAACGCTTCACGAATTTGC-3′。

3.6 雙螢光素酶報告實驗 構(gòu)建circFADS2野生型和突變型螢光素酶載體，將其分別與miR-NC或miR-491-5p 共轉(zhuǎn)染至RA-FLS 中，按照說明書檢測螢光素酶活性。將 si-NC、si-circFADS2、pcDNA 和 pcDNA-circFADS2 轉(zhuǎn)染至 RA-FLS 中，用 RT-qPCR 檢測 miR-491-5p的表達(dá)水平。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組間比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度杜仲皮水提取物對RA-FLS 細(xì)胞活力與凋亡的影響

與 NC 組比較，不同濃度 WEEC 組 RA-FLS 細(xì)胞活力降低，凋亡率升高，cleaved caspase-3 蛋白水平升高（P＜0.05），見圖1、表1。

表1 不同濃度杜仲皮水提取物對RA-FLS活力、凋亡及circFADS2和miR-491-5p 表達(dá)水平的影響Table 1. Effects of WEEC at different concentrations on the viability，apoptosis，and circFADS2 and miR-491-5p expression in the RA-FLS（Mean±SD. n=9）

2 circFADS2 和anti-miR-491-5p 均能逆轉(zhuǎn)杜仲皮水提取物對RA-FLS細(xì)胞活力與凋亡的干預(yù)作用

與 pcDNA+WEEC 組比較，pcDNA-circFADS2+WEEC 組的circFADS2 表達(dá)水平升高，細(xì)胞活力升高，細(xì)胞凋亡率及cleaved caspase-3 蛋白水平降低（P＜0.05），見圖2A、表2。

與 anti-miR-NC+WEEC 組比較，anti-miR-491-5p+WEEC 組的miR-491-5p 表達(dá)水平降低，細(xì)胞活力升高，細(xì)胞凋亡率及cleaved caspase-3 蛋白水平降低（P＜0.05），見圖2B、表2。

表2 pc-DNA-circFADS2和anti-miR-491-5p能逆轉(zhuǎn)杜仲皮水提取物對RA-FLS細(xì)胞活力與凋亡的干預(yù)作用Table 2. pc-DNA-circFADS2 or anti-miR-491-5p reversed the effect of WEEC on the viability and apoptosis of RA-FLS（Mean±SD.n=9）.

Figure 1. The effect of different concentrations of WEEC on the apoptosis of RA-FLS. A：flow cytometry was used to analyze the apoptosis of RA-FLS；B：Western blot was used to determine the relative protein level of cleaved caspase-3 in RA-FLS.圖1 不同濃度杜仲皮水提取物對RA-FLS凋亡的影響

3 circFADS2靶向調(diào)控miR-491-5p的表達(dá)

StarBssae 預(yù)測顯示 circFADS2 和 miR-491-5p 有互補的核苷酸序列；circFADS2 野生型報告質(zhì)粒與miR-491-5p 共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞螢光素酶活性顯著降低（P＜0.05），而 circFADS2 突變型報告質(zhì)粒與 miR-491-5p 共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞螢光素酶活性的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＞0.05）。抑制circFADS2表達(dá)后，miR-491-5p 的表達(dá)水平升高；過表達(dá)circFADS2 后，miR-491-5p的表達(dá)水平降低（P＜0.05），見圖3。

Figure 2. The representitive images of Western blot for detemining the protein levels of cleaved caspase-3 in the RA-FLS.圖2 Western blot檢測cleaved caspase-3蛋白水平的變化

4 miR-491-5p可逆轉(zhuǎn)pcDNA-circFADS2對WEEC處理的RA-FLS細(xì)胞活力與凋亡的影響

與miR-NC+pcDNA-circFADS2+WEEC 組比較，miR-491-5p+pcDNA-circFADS2+WEEC 組 的 miR-491-5p 表達(dá)水平升高，細(xì)胞活力降低，細(xì)胞凋亡率及cleaved-caspase-3 蛋白水平升高（P＜0.05），見圖2C、表3。

表3 miR-491-5p可逆轉(zhuǎn)pcDNA-circFADS2對杜仲皮水提取物處理的RA-FLS細(xì)胞活力與凋亡的影響Table 3. miR-491-5p reversed the effects of pcDNA-circFADS2 on the viability and apoptosis of WEEC-treated RA-FLS（Mean±SD.n=9）

討 論

成纖維樣滑膜細(xì)胞是RA 患者滑膜組織中的主要細(xì)胞類型之一，其可通過產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子以及過度增殖在RA 發(fā)病機理中起關(guān)鍵作用，誘導(dǎo)FLS 凋亡是中草藥治療RA 的重要機制［11-12］。杜仲有強筋骨的作用，為骨傷科常用藥物之一，杜仲及其有效成分具有較強的抗骨質(zhì)疏松癥活性，能通過誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)骨代謝、提高骨密度等途徑發(fā)揮對骨損傷的保護(hù)作用［13-15］。研究報道杜仲皮水提取物通過抑制PI3K/Akt 途徑抑制軟骨變性，減少炎癥細(xì)胞因子分泌，從而抑制骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展［16］。杜仲醇提取物體外能有效抑制RA-FLS 的增殖［17］。以上研究表明杜仲相關(guān)提取物具有治療骨損傷及關(guān)節(jié)炎等相關(guān)疾病的作用。本實驗用不同濃度杜仲皮水提取物處理RA-FLS，結(jié)果顯示，RA-FLS 的細(xì)胞活力降低，凋亡率及cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)水平升高，說明杜仲皮水提取物抑制了RA-FLS 增殖，并促進(jìn)其凋亡，提示杜仲皮水提取物可能具有治療RA 的作用。

Figure 3. Targeted regulation of miR-491-5p expression by circFADS2. A：StarBssae predicts the targeting relationship between circFADS2 and miR-491-5p；B：detection of dual luciferase activity after co-transfection of miR-NC or miR-491-5p with wild-type and mutant reporter plasmids into RA-FLS cells；C：RT-qPCR to detect the expression of circFADS2；D：RT-qPCR to detect the expression of miR-491-5p. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs miR-NC group；△P＜0.05 vs si-NC group；#P＜0.05 vs pcDNA group.圖3 circFADS2靶向調(diào)控miR-491-5p的表達(dá)

研究表明circRNA 廣泛參與了RA 滑膜細(xì)胞持續(xù)增生，滑膜炎癥，滑膜的纖維樣改變等［18］，如circ0088036的上調(diào)促進(jìn)了RA-FLS的增殖和遷移［19］。circAFF2 通過miR-375/TAB2 信號通路促進(jìn)RA-FLS的增殖和炎癥反應(yīng)［20］。已有研究報道circFADS2 影響軟骨細(xì)胞增殖及凋亡［9］，但 circFADS2 對 RA-FLS增殖、凋亡的影響尚不清楚。本實驗結(jié)果顯示，不同濃度杜仲皮水提取物處理后的RA-FLS 中circFADS2表達(dá)水平降低，miR-491-5p 表達(dá)水平升高；而轉(zhuǎn)染circFADS2 過表達(dá)載體或miR-491-5p 抑制表達(dá)載體后，用杜仲皮水提取物處理，細(xì)胞活力升高，細(xì)胞凋亡率及cleaved caspase-3 蛋白水平降低；表明過表達(dá)circFADS2或抑制miR-491-5p表達(dá)可促進(jìn)RA-FLS 生長，抑制其凋亡，兩者均可逆轉(zhuǎn)杜仲皮水提取物對RA-FLS 活力、凋亡的干預(yù)作用。本實驗還表明circ-FADS2 可靶向負(fù)調(diào)控 miR-491-5p，且 miR-491-5p 過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)circFADS2 對杜仲皮水提取物處理的RA-FLS生長與凋亡的影響。

綜上所述，杜仲皮水提取物可通過調(diào)節(jié)circ-FADS2/miR-491-5p 表達(dá)，抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維樣細(xì)胞生長，并促進(jìn)其凋亡。