亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        自噬和凋亡相關蛋白在腦缺血再灌注大鼠模型中的表達時間譜*

        2021-12-06 05:16:52張永杰趙曉明董玲玲何紅云鄧儀昊
        中國病理生理雜志 2021年11期
        關鍵詞:暗區(qū)腦缺血神經(jīng)功能

        郭 濤, 張永杰, 趙曉明, 董玲玲, 何紅云, 鄧儀昊

        (昆明理工大學醫(yī)學院解剖學教研室,腦卒中病理機制研究實驗室,云南昆明650500)

        腦卒中是最常見的神經(jīng)疾病,是世界范圍內(nèi)死亡的第二大原因和長期致殘的主要原因[1],其中大約87%的卒中病例為缺血性腦損傷[2]。腦缺血后的神經(jīng)元損傷是由復雜的病理因素引起的[3],包括炎癥[4]、氧化應激[5]、酸中毒[6]和興奮性毒性[7],導致細胞死亡[8]。而腦缺血引起3 種形態(tài)的細胞死亡:自噬、凋亡和壞死[9],目前對于它們之間相互的轉(zhuǎn)換和調(diào)控關系卻知之甚少。自噬是一個細胞過程,通過溶酶體降解回收聚集的蛋白質(zhì)、受損的細胞器和某些病原體,并通過向缺血細胞提供額外的能量供應和營養(yǎng)來提高細胞存活[10]。然而,自噬為一把雙刃劍,適當激活的自噬有益于大腦局部缺血后的神經(jīng)元存活[11],而過度活化的自噬最終導致細胞死亡[12]。凋亡是另一種類型的細胞死亡,經(jīng)歷凋亡的細胞以有組織的方式主動進行拆除,使鄰近神經(jīng)細胞的損傷和破壞達到最小,在疾病中對組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和發(fā)育起著重要作用[13]。

        基于本實驗室先前的研究和眾多研究者觀察,腦缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)發(fā)生后,自噬和凋亡被顯著激活,并且針對自噬和凋亡信號通路的干預治療在腦卒中疾病中發(fā)揮重要作用。但目前對于腦I/R 大鼠常用模型中自噬和凋亡不同時點表達水平的動態(tài)變化缺少統(tǒng)一的整理,研究者確定模型的時點和不同時期又各有不同,本文作為基礎研究在時間選擇上可以作為參考依據(jù)。事實上,缺血后病理過程中的細胞自噬和凋亡之間存在密切聯(lián)系。在缺血性腦卒中后的梗死核心區(qū)主要發(fā)生壞死,而周圍半暗區(qū)的細胞遭受自噬和凋亡,但不恰當?shù)淖允苫蜻^度凋亡可能導致細胞死亡[14]。

        另外,研究表明通過調(diào)節(jié)自噬和凋亡活性可以獲得針對腦I/R 損傷的神經(jīng)保護作用[15]。自噬和凋亡二者在腦卒中是否存在相互轉(zhuǎn)換,如何在不同時期使自噬和凋亡表達水平達到一個動態(tài)平衡及適度的活化狀態(tài)從而發(fā)揮神經(jīng)保護功能,將是本文的研究重點??傊芯看笫竽XI/R 后細胞自噬和凋亡不同時點的動態(tài)變化,并討論它們之間的相關變化和對神經(jīng)行為學、病理學發(fā)展的影響,可以找到新的線索來改善缺血性腦卒中的治療。

        材料和方法

        1 實驗動物

        選用SPF 級體質(zhì)量為250~280 g(8 周齡)的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(湘)2019-0004。本研究共使用了255 只大鼠:45 只大鼠術后死亡(死亡率為17.65%),納入210 只大鼠,138只大鼠分別用于評估神經(jīng)功能缺損和Western blot實驗,36 只大鼠用于腦梗死體積測量,其余36 只大鼠進行免疫熒光實驗。假手術(sham)組作為對照,每個時點為6 只大鼠(n=6)。每只大鼠在黑暗環(huán)境各12 h 和(22±1)℃下用福利動物程序飼養(yǎng),隨意飲用水和食物。所有大鼠實驗均經(jīng)昆明理工大學動物委員會批準。

        2 試劑和儀器

        BCA 蛋白濃度測定試劑盒、RIPA 裂解液和 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)試劑(碧云天生物科技有限公司);辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的山羊抗兔Ⅱ抗、微管相關蛋白1 輕鏈3(microtubuleassociated proteins 1 light chain 3,LC3)抗體、cleaved caspase-3(C-caspase-3)抗體、β-actin抗體、TUNEL 和DAPI 購自 Cell Signaling Technology;水合氯醛、電泳液、轉(zhuǎn)膜液和0.2%Triton X-100 購自北京Solarbio 科技有限公司。脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);冰凍離心機(湖南湘立科學儀器有限公司);電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(上海天能科技有限公司)。

        3 實驗方法

        3.1 動物模型制備 參照改良Zea Longa 法[16]制備左側(cè)大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注大鼠模型,腹腔注射10%水合氯醛(360 mg/kg)麻醉大鼠,置于加熱墊上保持體溫為(37.0±0.5)℃,左側(cè)頸總動脈(common carotid artery,CCA)、頸外動脈(external carotid artery,ECA)和頸內(nèi)動脈(internal carotid artery,ICA)分別與鄰近肌肉和神經(jīng)分開,并完全暴露。從ECA 的小切口插入涂有多聚賴氨酸圓形末端的栓線(直徑0.36 mm;北京西濃生物技術有限公司),并回到CCA,然后從ICA 進入大腦中動脈(middle cerebral artery,MCA),90 min 后拔出栓線,恢復血流。Sham 組的大鼠接受相同的手術,除了不插入拴線。

        3.2 評估神經(jīng)缺陷 分別在 I/R 后的 1~12 h、1~7 d、14 d、21 d 和28 d,采用改良神經(jīng)損傷嚴重程度評分(modified neurological severity scores,mNSS)評估大鼠神經(jīng)功能損傷情況(18 分制)[17]:分別從運動測試(正常0 分,最大6 分)、感覺實驗(正常0 分,最大2分)、平衡木實驗(正常0分,最大6分)和反射缺失或異常運動(正常0分,最大4分)4個方面進行評分。

        3.3 蛋白質(zhì)提取和Western blot 技術 神經(jīng)功能缺損評分后,在每個時點處死大鼠,冰上分離大腦皮層半暗區(qū)組織。通過自動研磨器將組織勻漿,用RIPA緩沖液裂解1 h,之后在冰凍離心機于4 ℃、12 800×g離心15 min 獲得上清蛋白。通過SDS-PAGE 分離上清液中的蛋白質(zhì)并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜中,在室溫下用10%脫脂牛奶封閉2 h。TPBS 洗滌PVDF 膜后,孵育 C-caspase-3、LC3 和 β-actin(1∶1 000)Ⅰ抗 4 ℃過夜。再次將膜與HRP 偶聯(lián)的Ⅱ抗在室溫下孵育1 h。用化學發(fā)光液通過BIO-RAD 系統(tǒng)曝光拍照,ImageJ軟件分析條帶灰度。

        3.4 腦梗死體積的測量 在sham 組和特征時點(6 h、12 h、2 d、7 d 和28 d)用10%水合氯醛(400 mg/kg)注射深度麻醉,取腦并在-20 ℃下冷凍20 min,然后用腦槽切片分成2 mm 厚的腦片。在TTC 溶液中染色30 min,并用4%多聚甲醛固定12 h。TTC 染色顯示梗死區(qū)組織呈蒼白色,正常腦組織為暗紅色。通過成像軟件(Adobe Photoshop 7.0)計算梗死體積,并通過梗死率(%)=A°/A′×100%來確定,A°代表梗死體積,A′代表同側(cè)半球的體積。

        3.5 免疫熒光染色 同樣,在6 h、12 h、2 d、7 d 和28 d 將大鼠麻醉并用生理鹽水經(jīng)心臟灌注,然后用4%多聚甲醛固定,取出完整大腦再用20%蔗糖溶液脫水,之后使用冷凍切片機冠狀位切成20 μm 厚的腦片,原位雜交保護液保存待用。用PBS 洗滌腦片,再用0.2% Triton X-100 透化15 min,10%正常牛血清封閉45 min,然后將腦片在4 ℃分別與LC3抗體和TUNEL 染液孵育過夜,37 ℃避光孵育熒光Ⅱ抗(1∶800)1 h,之后于DAPI溶液復染細胞核5 min,貼于載玻片并以抗熒光淬滅劑封片。通過熒光顯微鏡檢測反應信號,評估陽性細胞的百分比。

        4 統(tǒng)計學處理

        使用GraphPad Prism 5 軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)都以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

        結(jié) 果

        1 I/R后神經(jīng)功能缺損情況的變化

        相對于sham 組,腦I/R 大鼠模型在1 h 神經(jīng)功能顯著缺損(P<0.05),隨后1~6 h神經(jīng)功能缺損評分逐漸增加,6~12 h 繼續(xù)增加,在 I/R 后 4 d 達到最高水平,這幾個階段之間的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),然后維持此水平直到I/R 后28 d;假手術組中的所有大鼠都沒有表現(xiàn)出神經(jīng)缺陷,見圖1。

        2 I/R后自噬相關蛋白LC3的表達時間譜

        與sham 組相比,大鼠腦I/R 后1 h 半暗區(qū)的自噬顯著激活(P<0.05),LC3-II/LC3-I 比值從1~6 h 的腦缺血急性期逐漸增加,并且在12 h達到最高水平(P<0.05),在12 h~2 d 持續(xù)降低(P<0.05),在3~6 d 又開始增加(P<0.05),之后(7~28 d)維持在較高水平(沒有顯著波動),見圖2。

        3 I/R后凋亡相關蛋白C-caspase-3的表達時間譜

        腦I/R 后半暗區(qū)C-caspase-3的表達在1 h明顯激活(P<0.05),并在1~6 h 逐漸增大,直至12 h 后達到最大值(P<0.05);之后1~7 d,C-caspase-3 的表達持續(xù)下降(P<0.05),在7~28 d 時段里下降更明顯(P<0.05),且降至與sham組相近的表達水平,見圖3。

        4 I/R后半暗區(qū)自噬與凋亡轉(zhuǎn)換的動態(tài)變化

        為了觀察腦I/R 大鼠模型半暗區(qū)中細胞自噬與凋亡之間的相關變化,我們評估了LC3/C-caspase-3比值的差異。結(jié)果顯示,自噬和凋亡在I/R 后12 h內(nèi)保持穩(wěn)定,處于一種平衡狀態(tài),無顯著差異;但在12 h~2 d,LC3/C-caspase-3 比值顯著降低(P<0.05),自噬和凋亡水平在此階段均出現(xiàn)相對于12 h 的降低;不同的是,LC3/C-caspase-3 比值在3 d 時突然逆轉(zhuǎn),穩(wěn)定增加至 7 d,并在 7~28 d 持續(xù)快速增加(P<0.05),顯示出在大鼠I/R 后的亞急性期自噬水平升高而凋亡水平降低的現(xiàn)象,見圖4。

        Figure 1. Dynamic changes of neurological deficit scores at different time points after cerebral ischemia-reperfusion. Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs 1 h;△P<0.05 vs 6 h;▲P<0.05 vs 12 h.圖1 腦缺血再灌注后不同時點神經(jīng)功能缺損評分的動態(tài)變化

        Figure 2. Dynamic changes of LC3 expression level in the penumbra at different time points after cerebral ischemia-reperfusion.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs 1 h;△P<0.05 vs 6 h;▲P<0.05 vs 12 h;☆P<0.05 vs 2 d.圖2 腦缺血再灌注后不同時點半暗區(qū)LC3表達水平的動態(tài)變化

        Figure 3. Dynamic changes of cleaved caspase-3(C-caspase-3)expression level in the penumbra at different time points after cerebral ischemia-reperfusion. Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs 1 h;△P<0.05 vs 6 h;▲P<0.05 vs 12 h;☆P<0.05 vs 7 d.圖3 腦缺血再灌注后不同時點半暗區(qū)C-caspase-3表達水平的動態(tài)變化

        5 I/R后腦梗死體積的變化

        通過自噬與凋亡的表達在腦I/R 大鼠模型中動態(tài)變化的比較分析,選擇出特征時點6 h、12 h、2 d、7 d 和28 d 進行腦梗死體積檢測。結(jié)果顯示,與sham組相比,I/R后的急性期(6 h),腦梗死體積快速擴大,6~12 h 腦梗死體積持續(xù)急速增大(P<0.01);隨后在亞急性期(12 h~2 d、2~7 d 和7~28 d),腦梗死體積依舊持續(xù)增加(P<0.05),但相比急性期增速放緩,并在28 d 觀察到腦梗死核心區(qū)組織發(fā)生液化壞死現(xiàn)象,見圖5。

        6 免疫熒光法檢測I/R后自噬和凋亡的轉(zhuǎn)換

        為了進一步驗證腦I/R 后特征時點6 h、12 h、2 d、7 d 和28 d 半影區(qū)組織中自噬和凋亡的水平,我們通過免疫熒光評估LC3表達和TUNEL染色情況。正如 Western bolt 結(jié)果一樣,LC3 和 TUNEL 陽性細胞百分比在缺血后6 h內(nèi)逐漸增加,并且在12 h達到最大值(P<0.05);此后LC3陽性細胞的百分比在2 d顯著下降(P<0.05),之后幾周再次增長并維持在較高水平;但TUNEL 陽性細胞的比例從12 h至2 d相比LC3降低較少,與自噬水平趨勢相反的是,凋亡水平在2~28 d持續(xù)降低(P<0.05),見圖6。

        討 論

        Figure 4. Differential variations of autophagy and apoptosis in the penumbra after cerebral ischemia-reperfusion. Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs 12 h;#P<0.05 vs 2 d;△P<0.05 vs 7 d.圖4 腦缺血再灌注后半暗區(qū)自噬和凋亡的差異性變化

        Figure 5. The change of cerebral infarct volume after cerebral ischemia-reperfusion(TTC staining). Mean±SD. n=6.**P<0.01 vs sham group;##P<0.01 vs 6 h;△P<0.05 vs 12 h;▲P<0.05 vs 2 d;☆P<0.05 vs 7 d.圖5 腦缺血再灌注后腦梗死體積的變化

        腦缺血一旦發(fā)生,半暗區(qū)的自噬機制和凋亡信號都顯著激活[18],提示針對神經(jīng)細胞的拯救在腦I/R的病理生理過程中極為重要。自噬和凋亡分子機制存在共同通路,但它們在腦缺血中顯示的特異性效果卻不明確。過去的認識認為壞死是一種無法控制和不受管制的過程,而最近的研究表明壞死受調(diào)節(jié)的方式而改變,并且與細胞自噬和凋亡都具有共同的特征[19]。因此壞死、自噬和凋亡密切相關,參與了包括缺血性腦卒中在內(nèi)的各種疾病的發(fā)病機制[20]。洞察他們的相互作用和機制對找到更有效的腦缺血治療方法很重要。

        缺血核心區(qū)由于MCA 血流完全堵塞致使腦細胞死亡。而外圍的缺血半暗區(qū)被定義為具有形態(tài)完整性和保持能量代謝而氧、葡萄糖缺失的腦組織,是介于梗死灶和正常組織之間的移行區(qū)域,由于側(cè)支循環(huán)存在,仍可獲得部分血液能量供給,因而具有恢復能力[21]。研究觀察,腦I/R 后缺血半暗區(qū)可持續(xù)超過12 h,這為搶救提供了潛在機會[22]。與本文的研究結(jié)果類似,從腦缺血發(fā)生至4 d腦梗死體積持續(xù)擴大,表明在此期間的細胞調(diào)控都具有一定意義,并且提示早期12 h前及時治療對減少梗死體積的效果更佳。而自噬是一種可逆的細胞死亡形式,可以使細胞重生,其與壞死和凋亡使細胞最終走向死亡的命運不同,所以缺血半暗區(qū)的自噬是腦卒中具有吸引力的治療靶點。在Western blot技術中膜型LC3-II與胞漿型LC3-I 比值的大小可評估自噬水平的高低,LC3被作為自噬體形成的標志[23],C-caspase-3是凋亡啟動的必要條件[24],因此,本研究中 LC3 和 C-caspase-3分別作為檢測自噬和凋亡水平的金指標。

        Figure 6. Expression level of LC3 detected by immunofluorescence(A)and TUNEL staining(B)in the penumbra after cerebral ischemia-reperfusion. Autophagic cells were stained with LC3 antibody(red),apoptotic cells were TUNEL staining positive(green),and cell nuclei were visualized by DAPI(blue). The scale bar=10 μm. Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs 6 h;△P<0.05 vs 12 h;▲P<0.05 vs 2 d;☆P<0.05 vs 7 d.圖6 腦缺血再灌注半暗區(qū)LC3表達水平和TUNEL染色

        我們的結(jié)果顯示,腦梗死體積在大鼠腦I/R 后12 h 內(nèi)快速擴大,同時神經(jīng)功能缺損也逐漸加重,顯示神經(jīng)缺陷與腦梗死體積的擴大相一致。Li等[25]最近的研究結(jié)果得出了類似的結(jié)論,腦缺血發(fā)生后神經(jīng)損傷評分和腦梗死體積均急劇增加。另外,在此階段,半暗區(qū)中LC3 和C-caspase-3 的表達水平逐漸增加,并且在12 h達到最大。如上所述,同樣得到自噬和凋亡相關蛋白Beclin-1、Bcl-2 和Bax 的數(shù)據(jù)支持[26]。因此,可以通過調(diào)節(jié)自噬和凋亡的活化程度、抑制梗死體積的擴張和促進急性期的細胞存活來提供神經(jīng)保護功能。之后,亞急性期腦梗死體積從12 h 逐漸增大至28 d,同時,神經(jīng)感覺和運動功能缺陷也顯著增加。然而,半暗區(qū)的自噬和凋亡在這個階段顯示出不同的變化:LC3 的表達水平在12 h 后持續(xù)下降并在2 d 降至非常低的水平,C-caspase-3 的表達水平也降低,但是降低相對自噬較輕并仍然維持在高水平,表明自噬表達的下降可能是導致神經(jīng)功能缺陷增加的主要原因。這一結(jié)果實際上與以前的研究不一致[27],其顯示自噬抑制在腦缺血中具有神經(jīng)保護作用。分析不難發(fā)現(xiàn),不同的動物模型、干預措施以及時點可能會導致相反的結(jié)果。驚訝的是,腦I/R 損傷2 d 后LC3 表達水平突然改善,自噬明顯增加。相反,C-caspase-3 表達水平持續(xù)快速下降至28 d。這些結(jié)果提示2~28 d 亞急性期可能出現(xiàn)細胞凋亡向自噬的轉(zhuǎn)換,這種轉(zhuǎn)換在腦I/R 病理生理過程中發(fā)揮重要功能。因此,對于自噬和凋亡在大鼠腦缺血中的研究應該結(jié)合不同時期的特征時點進行綜合有效的分析救治,不論在時間上還是不同細胞分子信號機制的聯(lián)系上。

        有研究指出,自噬和凋亡的激活機制不僅發(fā)生在神經(jīng)元中[28],而且在神經(jīng)膠質(zhì)細胞中[29],甚至二者發(fā)生在同一個細胞中[30]。Xu 等[31]通過免疫熒光檢測腦I/R 后6 h 星形膠質(zhì)細胞的自噬顯著增加,但在缺血后12~24 h 其表現(xiàn)出凋亡和壞死形態(tài)特征。因此,我們預測在本研究中2 d后從細胞凋亡到自噬的轉(zhuǎn)變主要發(fā)生在神經(jīng)元而不是星形膠質(zhì)細胞中,并且大多研究結(jié)果也指示自噬多發(fā)生在神經(jīng)元中[32]。此外,在腦I/R 后4 d 梗死體積已達最大值,但LC3 和C-caspase-3 的表達仍可持續(xù)檢測,表明梗死體積不能完全代表壞死[33],因為TTC 染色標記的是組織中線粒體的活性,在半暗區(qū)中反而自噬和凋亡對細胞的存活有較大影響[34]。

        綜上所述,本研究表明腦缺血半暗區(qū)的自噬和凋亡在腦I/R 后表現(xiàn)出不同的時間變化,可以將急性期(6 和12 h)及亞急性期(2、7 和28 d)作為腦I/R 大鼠模型中自噬與凋亡研究的特征時點。本實驗為研究者進一步的機制研究提供了較為可靠的時點選擇。重要的是,我們發(fā)現(xiàn)在大鼠腦缺血亞急性期可能存在從細胞凋亡到自噬的轉(zhuǎn)換,半暗區(qū)的細胞凋亡水平顯著降低,但自噬仍維持在高水平,二者存在一定的相互作用,因此我們推測減弱過度自噬可能是此階段腦卒中治療的優(yōu)先任務。

        猜你喜歡
        暗區(qū)腦缺血神經(jīng)功能
        間歇性低氧干預對腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復的影響
        基于配準圖像與水平集算法的宮頸熒光多生暗區(qū)分割方法
        光束分析儀測量高階拉蓋爾高斯光束暗區(qū)半徑研究
        杭州市三年消除城市照明暗區(qū)3098處
        杭州(2016年2期)2016-08-15 00:54:59
        原花青素對腦缺血再灌注損傷后腸道功能的保護作用
        血必凈對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及其機制
        不同程度神經(jīng)功能缺損的腦梗死患者血尿酸與預后的相關性研究
        細胞外組蛋白與腦缺血再灌注損傷關系的初探
        辛伐他汀對腦出血大鼠神經(jīng)功能的保護作用及其機制探討
        基于光纖振動的激光散斑抑制方法的研究
        激光技術(2015年5期)2015-04-19 02:49:44
        成人免费xxxxx在线观看| 日本女优中文字幕有码| 国产在线av一区二区| 国产美女精品视频线免费播放软件| 国产在线精品一区二区| 精品国产亚洲一区二区三区演员表 | 视频在线亚洲视频在线| 国产精品毛片无码| 中文字幕亚洲好看有码| 精品亚洲国产亚洲国产| 国产无套一区二区三区久久| 亚洲综合网国产精品一区| 欧美午夜刺激影院| 好吊妞人成免费视频观看| 国产美女高潮流的白浆久久| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产精品无圣光一区二区| 五月婷网站| 国产在线视频一区二区三区不卡| av无码国产精品色午夜| 亚洲精品无播放器在线播放| 亚洲午夜看片无码| 亚洲一区二区精品在线| 娜娜麻豆国产电影| 无码AV高潮喷水无码专区线| 久久午夜伦鲁鲁片免费| 激情精品一区二区三区| 羞羞视频在线观看| 亚洲地区一区二区三区| 日本精品一区二区三区试看| 亚洲成a人片在线观看无码3d| 人妻丰满熟妇AV无码区HD| 强d乱码中文字幕熟女1000部| 蜜桃视频网站在线观看一区| 亚洲熟女乱色综合亚洲图片| 亚洲地区一区二区三区| 国产中文字幕亚洲精品| 无人区一码二码三码四码区| 國产AV天堂| 精品一区2区3区4区| 医院人妻闷声隔着帘子被中出 |