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        自噬和凋亡相關(guān)蛋白在腦缺血再灌注大鼠模型中的表達(dá)時(shí)間譜*

        2021-12-06 05:16:52張永杰趙曉明董玲玲何紅云鄧儀昊
        中國(guó)病理生理雜志 2021年11期
        關(guān)鍵詞:暗區(qū)腦缺血神經(jīng)功能

        郭 濤, 張永杰, 趙曉明, 董玲玲, 何紅云, 鄧儀昊

        (昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室,腦卒中病理機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)室,云南昆明650500)

        腦卒中是最常見(jiàn)的神經(jīng)疾病,是世界范圍內(nèi)死亡的第二大原因和長(zhǎng)期致殘的主要原因[1],其中大約87%的卒中病例為缺血性腦損傷[2]。腦缺血后的神經(jīng)元損傷是由復(fù)雜的病理因素引起的[3],包括炎癥[4]、氧化應(yīng)激[5]、酸中毒[6]和興奮性毒性[7],導(dǎo)致細(xì)胞死亡[8]。而腦缺血引起3 種形態(tài)的細(xì)胞死亡:自噬、凋亡和壞死[9],目前對(duì)于它們之間相互的轉(zhuǎn)換和調(diào)控關(guān)系卻知之甚少。自噬是一個(gè)細(xì)胞過(guò)程,通過(guò)溶酶體降解回收聚集的蛋白質(zhì)、受損的細(xì)胞器和某些病原體,并通過(guò)向缺血細(xì)胞提供額外的能量供應(yīng)和營(yíng)養(yǎng)來(lái)提高細(xì)胞存活[10]。然而,自噬為一把雙刃劍,適當(dāng)激活的自噬有益于大腦局部缺血后的神經(jīng)元存活[11],而過(guò)度活化的自噬最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[12]。凋亡是另一種類型的細(xì)胞死亡,經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞以有組織的方式主動(dòng)進(jìn)行拆除,使鄰近神經(jīng)細(xì)胞的損傷和破壞達(dá)到最小,在疾病中對(duì)組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和發(fā)育起著重要作用[13]。

        基于本實(shí)驗(yàn)室先前的研究和眾多研究者觀察,腦缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)發(fā)生后,自噬和凋亡被顯著激活,并且針對(duì)自噬和凋亡信號(hào)通路的干預(yù)治療在腦卒中疾病中發(fā)揮重要作用。但目前對(duì)于腦I/R 大鼠常用模型中自噬和凋亡不同時(shí)點(diǎn)表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化缺少統(tǒng)一的整理,研究者確定模型的時(shí)點(diǎn)和不同時(shí)期又各有不同,本文作為基礎(chǔ)研究在時(shí)間選擇上可以作為參考依據(jù)。事實(shí)上,缺血后病理過(guò)程中的細(xì)胞自噬和凋亡之間存在密切聯(lián)系。在缺血性腦卒中后的梗死核心區(qū)主要發(fā)生壞死,而周圍半暗區(qū)的細(xì)胞遭受自噬和凋亡,但不恰當(dāng)?shù)淖允苫蜻^(guò)度凋亡可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡[14]。

        另外,研究表明通過(guò)調(diào)節(jié)自噬和凋亡活性可以獲得針對(duì)腦I/R 損傷的神經(jīng)保護(hù)作用[15]。自噬和凋亡二者在腦卒中是否存在相互轉(zhuǎn)換,如何在不同時(shí)期使自噬和凋亡表達(dá)水平達(dá)到一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡及適度的活化狀態(tài)從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能,將是本文的研究重點(diǎn)??傊?,研究大鼠腦I/R 后細(xì)胞自噬和凋亡不同時(shí)點(diǎn)的動(dòng)態(tài)變化,并討論它們之間的相關(guān)變化和對(duì)神經(jīng)行為學(xué)、病理學(xué)發(fā)展的影響,可以找到新的線索來(lái)改善缺血性腦卒中的治療。

        材料和方法

        1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

        選用SPF 級(jí)體質(zhì)量為250~280 g(8 周齡)的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(湘)2019-0004。本研究共使用了255 只大鼠:45 只大鼠術(shù)后死亡(死亡率為17.65%),納入210 只大鼠,138只大鼠分別用于評(píng)估神經(jīng)功能缺損和Western blot實(shí)驗(yàn),36 只大鼠用于腦梗死體積測(cè)量,其余36 只大鼠進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)。假手術(shù)(sham)組作為對(duì)照,每個(gè)時(shí)點(diǎn)為6 只大鼠(n=6)。每只大鼠在黑暗環(huán)境各12 h 和(22±1)℃下用福利動(dòng)物程序飼養(yǎng),隨意飲用水和食物。所有大鼠實(shí)驗(yàn)均經(jīng)昆明理工大學(xué)動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)。

        2 試劑和儀器

        BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA 裂解液和 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)試劑(碧云天生物科技有限公司);辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗、微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3(microtubuleassociated proteins 1 light chain 3,LC3)抗體、cleaved caspase-3(C-caspase-3)抗體、β-actin抗體、TUNEL 和DAPI 購(gòu)自 Cell Signaling Technology;水合氯醛、電泳液、轉(zhuǎn)膜液和0.2%Triton X-100 購(gòu)自北京Solarbio 科技有限公司。脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);冰凍離心機(jī)(湖南湘立科學(xué)儀器有限公司);電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(上海天能科技有限公司)。

        3 實(shí)驗(yàn)方法

        3.1 動(dòng)物模型制備 參照改良Zea Longa 法[16]制備左側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注大鼠模型,腹腔注射10%水合氯醛(360 mg/kg)麻醉大鼠,置于加熱墊上保持體溫為(37.0±0.5)℃,左側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery,CCA)、頸外動(dòng)脈(external carotid artery,ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery,ICA)分別與鄰近肌肉和神經(jīng)分開(kāi),并完全暴露。從ECA 的小切口插入涂有多聚賴氨酸圓形末端的栓線(直徑0.36 mm;北京西濃生物技術(shù)有限公司),并回到CCA,然后從ICA 進(jìn)入大腦中動(dòng)脈(middle cerebral artery,MCA),90 min 后拔出栓線,恢復(fù)血流。Sham 組的大鼠接受相同的手術(shù),除了不插入拴線。

        3.2 評(píng)估神經(jīng)缺陷 分別在 I/R 后的 1~12 h、1~7 d、14 d、21 d 和28 d,采用改良神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度評(píng)分(modified neurological severity scores,mNSS)評(píng)估大鼠神經(jīng)功能損傷情況(18 分制)[17]:分別從運(yùn)動(dòng)測(cè)試(正常0 分,最大6 分)、感覺(jué)實(shí)驗(yàn)(正常0 分,最大2分)、平衡木實(shí)驗(yàn)(正常0分,最大6分)和反射缺失或異常運(yùn)動(dòng)(正常0分,最大4分)4個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分。

        3.3 蛋白質(zhì)提取和Western blot 技術(shù) 神經(jīng)功能缺損評(píng)分后,在每個(gè)時(shí)點(diǎn)處死大鼠,冰上分離大腦皮層半暗區(qū)組織。通過(guò)自動(dòng)研磨器將組織勻漿,用RIPA緩沖液裂解1 h,之后在冰凍離心機(jī)于4 ℃、12 800×g離心15 min 獲得上清蛋白。通過(guò)SDS-PAGE 分離上清液中的蛋白質(zhì)并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜中,在室溫下用10%脫脂牛奶封閉2 h。TPBS 洗滌PVDF 膜后,孵育 C-caspase-3、LC3 和 β-actin(1∶1 000)Ⅰ抗 4 ℃過(guò)夜。再次將膜與HRP 偶聯(lián)的Ⅱ抗在室溫下孵育1 h。用化學(xué)發(fā)光液通過(guò)BIO-RAD 系統(tǒng)曝光拍照,ImageJ軟件分析條帶灰度。

        3.4 腦梗死體積的測(cè)量 在sham 組和特征時(shí)點(diǎn)(6 h、12 h、2 d、7 d 和28 d)用10%水合氯醛(400 mg/kg)注射深度麻醉,取腦并在-20 ℃下冷凍20 min,然后用腦槽切片分成2 mm 厚的腦片。在TTC 溶液中染色30 min,并用4%多聚甲醛固定12 h。TTC 染色顯示梗死區(qū)組織呈蒼白色,正常腦組織為暗紅色。通過(guò)成像軟件(Adobe Photoshop 7.0)計(jì)算梗死體積,并通過(guò)梗死率(%)=A°/A′×100%來(lái)確定,A°代表梗死體積,A′代表同側(cè)半球的體積。

        3.5 免疫熒光染色 同樣,在6 h、12 h、2 d、7 d 和28 d 將大鼠麻醉并用生理鹽水經(jīng)心臟灌注,然后用4%多聚甲醛固定,取出完整大腦再用20%蔗糖溶液脫水,之后使用冷凍切片機(jī)冠狀位切成20 μm 厚的腦片,原位雜交保護(hù)液保存待用。用PBS 洗滌腦片,再用0.2% Triton X-100 透化15 min,10%正常牛血清封閉45 min,然后將腦片在4 ℃分別與LC3抗體和TUNEL 染液孵育過(guò)夜,37 ℃避光孵育熒光Ⅱ抗(1∶800)1 h,之后于DAPI溶液復(fù)染細(xì)胞核5 min,貼于載玻片并以抗熒光淬滅劑封片。通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)反應(yīng)信號(hào),評(píng)估陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。

        4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        使用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)都以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1 I/R后神經(jīng)功能缺損情況的變化

        相對(duì)于sham 組,腦I/R 大鼠模型在1 h 神經(jīng)功能顯著缺損(P<0.05),隨后1~6 h神經(jīng)功能缺損評(píng)分逐漸增加,6~12 h 繼續(xù)增加,在 I/R 后 4 d 達(dá)到最高水平,這幾個(gè)階段之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),然后維持此水平直到I/R 后28 d;假手術(shù)組中的所有大鼠都沒(méi)有表現(xiàn)出神經(jīng)缺陷,見(jiàn)圖1。

        2 I/R后自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)時(shí)間譜

        與sham 組相比,大鼠腦I/R 后1 h 半暗區(qū)的自噬顯著激活(P<0.05),LC3-II/LC3-I 比值從1~6 h 的腦缺血急性期逐漸增加,并且在12 h達(dá)到最高水平(P<0.05),在12 h~2 d 持續(xù)降低(P<0.05),在3~6 d 又開(kāi)始增加(P<0.05),之后(7~28 d)維持在較高水平(沒(méi)有顯著波動(dòng)),見(jiàn)圖2。

        3 I/R后凋亡相關(guān)蛋白C-caspase-3的表達(dá)時(shí)間譜

        腦I/R 后半暗區(qū)C-caspase-3的表達(dá)在1 h明顯激活(P<0.05),并在1~6 h 逐漸增大,直至12 h 后達(dá)到最大值(P<0.05);之后1~7 d,C-caspase-3 的表達(dá)持續(xù)下降(P<0.05),在7~28 d 時(shí)段里下降更明顯(P<0.05),且降至與sham組相近的表達(dá)水平,見(jiàn)圖3。

        4 I/R后半暗區(qū)自噬與凋亡轉(zhuǎn)換的動(dòng)態(tài)變化

        為了觀察腦I/R 大鼠模型半暗區(qū)中細(xì)胞自噬與凋亡之間的相關(guān)變化,我們?cè)u(píng)估了LC3/C-caspase-3比值的差異。結(jié)果顯示,自噬和凋亡在I/R 后12 h內(nèi)保持穩(wěn)定,處于一種平衡狀態(tài),無(wú)顯著差異;但在12 h~2 d,LC3/C-caspase-3 比值顯著降低(P<0.05),自噬和凋亡水平在此階段均出現(xiàn)相對(duì)于12 h 的降低;不同的是,LC3/C-caspase-3 比值在3 d 時(shí)突然逆轉(zhuǎn),穩(wěn)定增加至 7 d,并在 7~28 d 持續(xù)快速增加(P<0.05),顯示出在大鼠I/R 后的亞急性期自噬水平升高而凋亡水平降低的現(xiàn)象,見(jiàn)圖4。

        Figure 1. Dynamic changes of neurological deficit scores at different time points after cerebral ischemia-reperfusion. Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs 1 h;△P<0.05 vs 6 h;▲P<0.05 vs 12 h.圖1 腦缺血再灌注后不同時(shí)點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分的動(dòng)態(tài)變化

        Figure 2. Dynamic changes of LC3 expression level in the penumbra at different time points after cerebral ischemia-reperfusion.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs 1 h;△P<0.05 vs 6 h;▲P<0.05 vs 12 h;☆P<0.05 vs 2 d.圖2 腦缺血再灌注后不同時(shí)點(diǎn)半暗區(qū)LC3表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化

        Figure 3. Dynamic changes of cleaved caspase-3(C-caspase-3)expression level in the penumbra at different time points after cerebral ischemia-reperfusion. Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs 1 h;△P<0.05 vs 6 h;▲P<0.05 vs 12 h;☆P<0.05 vs 7 d.圖3 腦缺血再灌注后不同時(shí)點(diǎn)半暗區(qū)C-caspase-3表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化

        5 I/R后腦梗死體積的變化

        通過(guò)自噬與凋亡的表達(dá)在腦I/R 大鼠模型中動(dòng)態(tài)變化的比較分析,選擇出特征時(shí)點(diǎn)6 h、12 h、2 d、7 d 和28 d 進(jìn)行腦梗死體積檢測(cè)。結(jié)果顯示,與sham組相比,I/R后的急性期(6 h),腦梗死體積快速擴(kuò)大,6~12 h 腦梗死體積持續(xù)急速增大(P<0.01);隨后在亞急性期(12 h~2 d、2~7 d 和7~28 d),腦梗死體積依舊持續(xù)增加(P<0.05),但相比急性期增速放緩,并在28 d 觀察到腦梗死核心區(qū)組織發(fā)生液化壞死現(xiàn)象,見(jiàn)圖5。

        6 免疫熒光法檢測(cè)I/R后自噬和凋亡的轉(zhuǎn)換

        為了進(jìn)一步驗(yàn)證腦I/R 后特征時(shí)點(diǎn)6 h、12 h、2 d、7 d 和28 d 半影區(qū)組織中自噬和凋亡的水平,我們通過(guò)免疫熒光評(píng)估LC3表達(dá)和TUNEL染色情況。正如 Western bolt 結(jié)果一樣,LC3 和 TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞百分比在缺血后6 h內(nèi)逐漸增加,并且在12 h達(dá)到最大值(P<0.05);此后LC3陽(yáng)性細(xì)胞的百分比在2 d顯著下降(P<0.05),之后幾周再次增長(zhǎng)并維持在較高水平;但TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞的比例從12 h至2 d相比LC3降低較少,與自噬水平趨勢(shì)相反的是,凋亡水平在2~28 d持續(xù)降低(P<0.05),見(jiàn)圖6。

        討 論

        Figure 4. Differential variations of autophagy and apoptosis in the penumbra after cerebral ischemia-reperfusion. Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs 12 h;#P<0.05 vs 2 d;△P<0.05 vs 7 d.圖4 腦缺血再灌注后半暗區(qū)自噬和凋亡的差異性變化

        Figure 5. The change of cerebral infarct volume after cerebral ischemia-reperfusion(TTC staining). Mean±SD. n=6.**P<0.01 vs sham group;##P<0.01 vs 6 h;△P<0.05 vs 12 h;▲P<0.05 vs 2 d;☆P<0.05 vs 7 d.圖5 腦缺血再灌注后腦梗死體積的變化

        腦缺血一旦發(fā)生,半暗區(qū)的自噬機(jī)制和凋亡信號(hào)都顯著激活[18],提示針對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的拯救在腦I/R的病理生理過(guò)程中極為重要。自噬和凋亡分子機(jī)制存在共同通路,但它們?cè)谀X缺血中顯示的特異性效果卻不明確。過(guò)去的認(rèn)識(shí)認(rèn)為壞死是一種無(wú)法控制和不受管制的過(guò)程,而最近的研究表明壞死受調(diào)節(jié)的方式而改變,并且與細(xì)胞自噬和凋亡都具有共同的特征[19]。因此壞死、自噬和凋亡密切相關(guān),參與了包括缺血性腦卒中在內(nèi)的各種疾病的發(fā)病機(jī)制[20]。洞察他們的相互作用和機(jī)制對(duì)找到更有效的腦缺血治療方法很重要。

        缺血核心區(qū)由于MCA 血流完全堵塞致使腦細(xì)胞死亡。而外圍的缺血半暗區(qū)被定義為具有形態(tài)完整性和保持能量代謝而氧、葡萄糖缺失的腦組織,是介于梗死灶和正常組織之間的移行區(qū)域,由于側(cè)支循環(huán)存在,仍可獲得部分血液能量供給,因而具有恢復(fù)能力[21]。研究觀察,腦I/R 后缺血半暗區(qū)可持續(xù)超過(guò)12 h,這為搶救提供了潛在機(jī)會(huì)[22]。與本文的研究結(jié)果類似,從腦缺血發(fā)生至4 d腦梗死體積持續(xù)擴(kuò)大,表明在此期間的細(xì)胞調(diào)控都具有一定意義,并且提示早期12 h前及時(shí)治療對(duì)減少梗死體積的效果更佳。而自噬是一種可逆的細(xì)胞死亡形式,可以使細(xì)胞重生,其與壞死和凋亡使細(xì)胞最終走向死亡的命運(yùn)不同,所以缺血半暗區(qū)的自噬是腦卒中具有吸引力的治療靶點(diǎn)。在Western blot技術(shù)中膜型LC3-II與胞漿型LC3-I 比值的大小可評(píng)估自噬水平的高低,LC3被作為自噬體形成的標(biāo)志[23],C-caspase-3是凋亡啟動(dòng)的必要條件[24],因此,本研究中 LC3 和 C-caspase-3分別作為檢測(cè)自噬和凋亡水平的金指標(biāo)。

        Figure 6. Expression level of LC3 detected by immunofluorescence(A)and TUNEL staining(B)in the penumbra after cerebral ischemia-reperfusion. Autophagic cells were stained with LC3 antibody(red),apoptotic cells were TUNEL staining positive(green),and cell nuclei were visualized by DAPI(blue). The scale bar=10 μm. Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs 6 h;△P<0.05 vs 12 h;▲P<0.05 vs 2 d;☆P<0.05 vs 7 d.圖6 腦缺血再灌注半暗區(qū)LC3表達(dá)水平和TUNEL染色

        我們的結(jié)果顯示,腦梗死體積在大鼠腦I/R 后12 h 內(nèi)快速擴(kuò)大,同時(shí)神經(jīng)功能缺損也逐漸加重,顯示神經(jīng)缺陷與腦梗死體積的擴(kuò)大相一致。Li等[25]最近的研究結(jié)果得出了類似的結(jié)論,腦缺血發(fā)生后神經(jīng)損傷評(píng)分和腦梗死體積均急劇增加。另外,在此階段,半暗區(qū)中LC3 和C-caspase-3 的表達(dá)水平逐漸增加,并且在12 h達(dá)到最大。如上所述,同樣得到自噬和凋亡相關(guān)蛋白Beclin-1、Bcl-2 和Bax 的數(shù)據(jù)支持[26]。因此,可以通過(guò)調(diào)節(jié)自噬和凋亡的活化程度、抑制梗死體積的擴(kuò)張和促進(jìn)急性期的細(xì)胞存活來(lái)提供神經(jīng)保護(hù)功能。之后,亞急性期腦梗死體積從12 h 逐漸增大至28 d,同時(shí),神經(jīng)感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)功能缺陷也顯著增加。然而,半暗區(qū)的自噬和凋亡在這個(gè)階段顯示出不同的變化:LC3 的表達(dá)水平在12 h 后持續(xù)下降并在2 d 降至非常低的水平,C-caspase-3 的表達(dá)水平也降低,但是降低相對(duì)自噬較輕并仍然維持在高水平,表明自噬表達(dá)的下降可能是導(dǎo)致神經(jīng)功能缺陷增加的主要原因。這一結(jié)果實(shí)際上與以前的研究不一致[27],其顯示自噬抑制在腦缺血中具有神經(jīng)保護(hù)作用。分析不難發(fā)現(xiàn),不同的動(dòng)物模型、干預(yù)措施以及時(shí)點(diǎn)可能會(huì)導(dǎo)致相反的結(jié)果。驚訝的是,腦I/R 損傷2 d 后LC3 表達(dá)水平突然改善,自噬明顯增加。相反,C-caspase-3 表達(dá)水平持續(xù)快速下降至28 d。這些結(jié)果提示2~28 d 亞急性期可能出現(xiàn)細(xì)胞凋亡向自噬的轉(zhuǎn)換,這種轉(zhuǎn)換在腦I/R 病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要功能。因此,對(duì)于自噬和凋亡在大鼠腦缺血中的研究應(yīng)該結(jié)合不同時(shí)期的特征時(shí)點(diǎn)進(jìn)行綜合有效的分析救治,不論在時(shí)間上還是不同細(xì)胞分子信號(hào)機(jī)制的聯(lián)系上。

        有研究指出,自噬和凋亡的激活機(jī)制不僅發(fā)生在神經(jīng)元中[28],而且在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中[29],甚至二者發(fā)生在同一個(gè)細(xì)胞中[30]。Xu 等[31]通過(guò)免疫熒光檢測(cè)腦I/R 后6 h 星形膠質(zhì)細(xì)胞的自噬顯著增加,但在缺血后12~24 h 其表現(xiàn)出凋亡和壞死形態(tài)特征。因此,我們預(yù)測(cè)在本研究中2 d后從細(xì)胞凋亡到自噬的轉(zhuǎn)變主要發(fā)生在神經(jīng)元而不是星形膠質(zhì)細(xì)胞中,并且大多研究結(jié)果也指示自噬多發(fā)生在神經(jīng)元中[32]。此外,在腦I/R 后4 d 梗死體積已達(dá)最大值,但LC3 和C-caspase-3 的表達(dá)仍可持續(xù)檢測(cè),表明梗死體積不能完全代表壞死[33],因?yàn)門TC 染色標(biāo)記的是組織中線粒體的活性,在半暗區(qū)中反而自噬和凋亡對(duì)細(xì)胞的存活有較大影響[34]。

        綜上所述,本研究表明腦缺血半暗區(qū)的自噬和凋亡在腦I/R 后表現(xiàn)出不同的時(shí)間變化,可以將急性期(6 和12 h)及亞急性期(2、7 和28 d)作為腦I/R 大鼠模型中自噬與凋亡研究的特征時(shí)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)為研究者進(jìn)一步的機(jī)制研究提供了較為可靠的時(shí)點(diǎn)選擇。重要的是,我們發(fā)現(xiàn)在大鼠腦缺血亞急性期可能存在從細(xì)胞凋亡到自噬的轉(zhuǎn)換,半暗區(qū)的細(xì)胞凋亡水平顯著降低,但自噬仍維持在高水平,二者存在一定的相互作用,因此我們推測(cè)減弱過(guò)度自噬可能是此階段腦卒中治療的優(yōu)先任務(wù)。

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