郭 濤， 張永杰， 趙曉明， 董玲玲， 何紅云， 鄧儀昊

（昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，腦卒中病理機(jī)制研究實(shí)驗室，云南昆明650500）

腦卒中是最常見的神經(jīng)疾病，是世界范圍內(nèi)死亡的第二大原因和長期致殘的主要原因［1］，其中大約87%的卒中病例為缺血性腦損傷［2］。腦缺血后的神經(jīng)元損傷是由復(fù)雜的病理因素引起的［3］，包括炎癥［4］、氧化應(yīng)激［5］、酸中毒［6］和興奮性毒性［7］，導(dǎo)致細(xì)胞死亡［8］。而腦缺血引起3 種形態(tài)的細(xì)胞死亡：自噬、凋亡和壞死［9］，目前對于它們之間相互的轉(zhuǎn)換和調(diào)控關(guān)系卻知之甚少。自噬是一個細(xì)胞過程，通過溶酶體降解回收聚集的蛋白質(zhì)、受損的細(xì)胞器和某些病原體，并通過向缺血細(xì)胞提供額外的能量供應(yīng)和營養(yǎng)來提高細(xì)胞存活［10］。然而，自噬為一把雙刃劍，適當(dāng)激活的自噬有益于大腦局部缺血后的神經(jīng)元存活［11］，而過度活化的自噬最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［12］。凋亡是另一種類型的細(xì)胞死亡，經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞以有組織的方式主動進(jìn)行拆除，使鄰近神經(jīng)細(xì)胞的損傷和破壞達(dá)到最小，在疾病中對組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和發(fā)育起著重要作用［13］。

基于本實(shí)驗室先前的研究和眾多研究者觀察，腦缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）發(fā)生后，自噬和凋亡被顯著激活，并且針對自噬和凋亡信號通路的干預(yù)治療在腦卒中疾病中發(fā)揮重要作用。但目前對于腦I/R 大鼠常用模型中自噬和凋亡不同時點(diǎn)表達(dá)水平的動態(tài)變化缺少統(tǒng)一的整理，研究者確定模型的時點(diǎn)和不同時期又各有不同，本文作為基礎(chǔ)研究在時間選擇上可以作為參考依據(jù)。事實(shí)上，缺血后病理過程中的細(xì)胞自噬和凋亡之間存在密切聯(lián)系。在缺血性腦卒中后的梗死核心區(qū)主要發(fā)生壞死，而周圍半暗區(qū)的細(xì)胞遭受自噬和凋亡，但不恰當(dāng)?shù)淖允苫蜻^度凋亡可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡［14］。

另外，研究表明通過調(diào)節(jié)自噬和凋亡活性可以獲得針對腦I/R 損傷的神經(jīng)保護(hù)作用［15］。自噬和凋亡二者在腦卒中是否存在相互轉(zhuǎn)換，如何在不同時期使自噬和凋亡表達(dá)水平達(dá)到一個動態(tài)平衡及適度的活化狀態(tài)從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能，將是本文的研究重點(diǎn)?？傊芯看笫竽XI/R 后細(xì)胞自噬和凋亡不同時點(diǎn)的動態(tài)變化，并討論它們之間的相關(guān)變化和對神經(jīng)行為學(xué)、病理學(xué)發(fā)展的影響，可以找到新的線索來改善缺血性腦卒中的治療。

材料和方法

1 實(shí)驗動物

選用SPF 級體質(zhì)量為250～280 g（8 周齡）的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗動物有限公司，實(shí)驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）2019-0004。本研究共使用了255 只大鼠：45 只大鼠術(shù)后死亡（死亡率為17.65%），納入210 只大鼠，138只大鼠分別用于評估神經(jīng)功能缺損和Western blot實(shí)驗，36 只大鼠用于腦梗死體積測量，其余36 只大鼠進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗。假手術(shù)（sham）組作為對照，每個時點(diǎn)為6 只大鼠（n=6）。每只大鼠在黑暗環(huán)境各12 h 和（22±1）℃下用福利動物程序飼養(yǎng)，隨意飲用水和食物。所有大鼠實(shí)驗均經(jīng)昆明理工大學(xué)動物委員會批準(zhǔn)。

2 試劑和儀器

BCA 蛋白濃度測定試劑盒、RIPA 裂解液和 2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）試劑（碧云天生物科技有限公司）；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗、微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubuleassociated proteins 1 light chain 3，LC3）抗體、cleaved caspase-3（C-caspase-3）抗體、β-actin抗體、TUNEL 和DAPI 購自 Cell Signaling Technology；水合氯醛、電泳液、轉(zhuǎn)膜液和0.2%Triton X-100 購自北京Solarbio 科技有限公司。脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；冰凍離心機(jī)（湖南湘立科學(xué)儀器有限公司）；電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀（上海天能科技有限公司）。

3 實(shí)驗方法

3.1 動物模型制備 參照改良Zea Longa 法［16］制備左側(cè)大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）再灌注大鼠模型，腹腔注射10%水合氯醛（360 mg/kg）麻醉大鼠，置于加熱墊上保持體溫為（37.0±0.5）℃，左側(cè)頸總動脈（common carotid artery，CCA）、頸外動脈（external carotid artery，ECA）和頸內(nèi)動脈（internal carotid artery，ICA）分別與鄰近肌肉和神經(jīng)分開，并完全暴露。從ECA 的小切口插入涂有多聚賴氨酸圓形末端的栓線（直徑0.36 mm；北京西濃生物技術(shù)有限公司），并回到CCA，然后從ICA 進(jìn)入大腦中動脈（middle cerebral artery，MCA），90 min 后拔出栓線，恢復(fù)血流。Sham 組的大鼠接受相同的手術(shù)，除了不插入拴線。

3.2 評估神經(jīng)缺陷 分別在 I/R 后的 1～12 h、1～7 d、14 d、21 d 和28 d，采用改良神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度評分（modified neurological severity scores，mNSS）評估大鼠神經(jīng)功能損傷情況（18 分制）［17］：分別從運(yùn)動測試（正常0 分，最大6 分）、感覺實(shí)驗（正常0 分，最大2分）、平衡木實(shí)驗（正常0分，最大6分）和反射缺失或異常運(yùn)動（正常0分，最大4分）4個方面進(jìn)行評分。

3.3 蛋白質(zhì)提取和Western blot 技術(shù) 神經(jīng)功能缺損評分后，在每個時點(diǎn)處死大鼠，冰上分離大腦皮層半暗區(qū)組織。通過自動研磨器將組織勻漿，用RIPA緩沖液裂解1 h，之后在冰凍離心機(jī)于4 ℃、12 800×g離心15 min 獲得上清蛋白。通過SDS-PAGE 分離上清液中的蛋白質(zhì)并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜中，在室溫下用10%脫脂牛奶封閉2 h。TPBS 洗滌PVDF 膜后，孵育 C-caspase-3、LC3 和 β-actin（1∶1 000）Ⅰ抗 4 ℃過夜。再次將膜與HRP 偶聯(lián)的Ⅱ抗在室溫下孵育1 h。用化學(xué)發(fā)光液通過BIO-RAD 系統(tǒng)曝光拍照，ImageJ軟件分析條帶灰度。

3.4 腦梗死體積的測量 在sham 組和特征時點(diǎn)（6 h、12 h、2 d、7 d 和28 d）用10%水合氯醛（400 mg/kg）注射深度麻醉，取腦并在-20 ℃下冷凍20 min，然后用腦槽切片分成2 mm 厚的腦片。在TTC 溶液中染色30 min，并用4%多聚甲醛固定12 h。TTC 染色顯示梗死區(qū)組織呈蒼白色，正常腦組織為暗紅色。通過成像軟件（Adobe Photoshop 7.0）計算梗死體積，并通過梗死率（%）=A°/A′×100%來確定，A°代表梗死體積，A′代表同側(cè)半球的體積。

3.5 免疫熒光染色 同樣，在6 h、12 h、2 d、7 d 和28 d 將大鼠麻醉并用生理鹽水經(jīng)心臟灌注，然后用4%多聚甲醛固定，取出完整大腦再用20%蔗糖溶液脫水，之后使用冷凍切片機(jī)冠狀位切成20 μm 厚的腦片，原位雜交保護(hù)液保存待用。用PBS 洗滌腦片，再用0.2% Triton X-100 透化15 min，10%正常牛血清封閉45 min，然后將腦片在4 ℃分別與LC3抗體和TUNEL 染液孵育過夜，37 ℃避光孵育熒光Ⅱ抗（1∶800）1 h，之后于DAPI溶液復(fù)染細(xì)胞核5 min，貼于載玻片并以抗熒光淬滅劑封片。通過熒光顯微鏡檢測反應(yīng)信號，評估陽性細(xì)胞的百分比。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)都以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 I/R后神經(jīng)功能缺損情況的變化

相對于sham 組，腦I/R 大鼠模型在1 h 神經(jīng)功能顯著缺損（P＜0.05），隨后1～6 h神經(jīng)功能缺損評分逐漸增加，6～12 h 繼續(xù)增加，在 I/R 后 4 d 達(dá)到最高水平，這幾個階段之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），然后維持此水平直到I/R 后28 d；假手術(shù)組中的所有大鼠都沒有表現(xiàn)出神經(jīng)缺陷，見圖1。

2 I/R后自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)時間譜

與sham 組相比，大鼠腦I/R 后1 h 半暗區(qū)的自噬顯著激活（P＜0.05），LC3-II/LC3-I 比值從1～6 h 的腦缺血急性期逐漸增加，并且在12 h達(dá)到最高水平（P＜0.05），在12 h～2 d 持續(xù)降低（P＜0.05），在3～6 d 又開始增加（P＜0.05），之后（7～28 d）維持在較高水平（沒有顯著波動），見圖2。

3 I/R后凋亡相關(guān)蛋白C-caspase-3的表達(dá)時間譜

腦I/R 后半暗區(qū)C-caspase-3的表達(dá)在1 h明顯激活（P＜0.05），并在1～6 h 逐漸增大，直至12 h 后達(dá)到最大值（P＜0.05）；之后1～7 d，C-caspase-3 的表達(dá)持續(xù)下降（P＜0.05），在7～28 d 時段里下降更明顯（P＜0.05），且降至與sham組相近的表達(dá)水平，見圖3。

4 I/R后半暗區(qū)自噬與凋亡轉(zhuǎn)換的動態(tài)變化

為了觀察腦I/R 大鼠模型半暗區(qū)中細(xì)胞自噬與凋亡之間的相關(guān)變化，我們評估了LC3/C-caspase-3比值的差異。結(jié)果顯示，自噬和凋亡在I/R 后12 h內(nèi)保持穩(wěn)定，處于一種平衡狀態(tài)，無顯著差異；但在12 h～2 d，LC3/C-caspase-3 比值顯著降低（P＜0.05），自噬和凋亡水平在此階段均出現(xiàn)相對于12 h 的降低；不同的是，LC3/C-caspase-3 比值在3 d 時突然逆轉(zhuǎn)，穩(wěn)定增加至 7 d，并在 7～28 d 持續(xù)快速增加（P＜0.05），顯示出在大鼠I/R 后的亞急性期自噬水平升高而凋亡水平降低的現(xiàn)象，見圖4。

Figure 1. Dynamic changes of neurological deficit scores at different time points after cerebral ischemia-reperfusion. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs 1 h；△P＜0.05 vs 6 h；▲P＜0.05 vs 12 h.圖1 腦缺血再灌注后不同時點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分的動態(tài)變化

Figure 2. Dynamic changes of LC3 expression level in the penumbra at different time points after cerebral ischemia-reperfusion.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs 1 h；△P＜0.05 vs 6 h；▲P＜0.05 vs 12 h；☆P＜0.05 vs 2 d.圖2 腦缺血再灌注后不同時點(diǎn)半暗區(qū)LC3表達(dá)水平的動態(tài)變化

Figure 3. Dynamic changes of cleaved caspase-3（C-caspase-3）expression level in the penumbra at different time points after cerebral ischemia-reperfusion. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs 1 h；△P＜0.05 vs 6 h；▲P＜0.05 vs 12 h；☆P＜0.05 vs 7 d.圖3 腦缺血再灌注后不同時點(diǎn)半暗區(qū)C-caspase-3表達(dá)水平的動態(tài)變化

5 I/R后腦梗死體積的變化

通過自噬與凋亡的表達(dá)在腦I/R 大鼠模型中動態(tài)變化的比較分析，選擇出特征時點(diǎn)6 h、12 h、2 d、7 d 和28 d 進(jìn)行腦梗死體積檢測。結(jié)果顯示，與sham組相比，I/R后的急性期（6 h），腦梗死體積快速擴(kuò)大，6～12 h 腦梗死體積持續(xù)急速增大（P＜0.01）；隨后在亞急性期（12 h～2 d、2～7 d 和7～28 d），腦梗死體積依舊持續(xù)增加（P＜0.05），但相比急性期增速放緩，并在28 d 觀察到腦梗死核心區(qū)組織發(fā)生液化壞死現(xiàn)象，見圖5。

6 免疫熒光法檢測I/R后自噬和凋亡的轉(zhuǎn)換

為了進(jìn)一步驗證腦I/R 后特征時點(diǎn)6 h、12 h、2 d、7 d 和28 d 半影區(qū)組織中自噬和凋亡的水平，我們通過免疫熒光評估LC3表達(dá)和TUNEL染色情況。正如 Western bolt 結(jié)果一樣，LC3 和 TUNEL 陽性細(xì)胞百分比在缺血后6 h內(nèi)逐漸增加，并且在12 h達(dá)到最大值（P＜0.05）；此后LC3陽性細(xì)胞的百分比在2 d顯著下降（P＜0.05），之后幾周再次增長并維持在較高水平；但TUNEL 陽性細(xì)胞的比例從12 h至2 d相比LC3降低較少，與自噬水平趨勢相反的是，凋亡水平在2～28 d持續(xù)降低（P＜0.05），見圖6。

討 論

Figure 4. Differential variations of autophagy and apoptosis in the penumbra after cerebral ischemia-reperfusion. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs 12 h；#P＜0.05 vs 2 d；△P＜0.05 vs 7 d.圖4 腦缺血再灌注后半暗區(qū)自噬和凋亡的差異性變化

Figure 5. The change of cerebral infarct volume after cerebral ischemia-reperfusion（TTC staining）. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs 6 h；△P＜0.05 vs 12 h；▲P＜0.05 vs 2 d；☆P＜0.05 vs 7 d.圖5 腦缺血再灌注后腦梗死體積的變化

腦缺血一旦發(fā)生，半暗區(qū)的自噬機(jī)制和凋亡信號都顯著激活［18］，提示針對神經(jīng)細(xì)胞的拯救在腦I/R的病理生理過程中極為重要。自噬和凋亡分子機(jī)制存在共同通路，但它們在腦缺血中顯示的特異性效果卻不明確。過去的認(rèn)識認(rèn)為壞死是一種無法控制和不受管制的過程，而最近的研究表明壞死受調(diào)節(jié)的方式而改變，并且與細(xì)胞自噬和凋亡都具有共同的特征［19］。因此壞死、自噬和凋亡密切相關(guān)，參與了包括缺血性腦卒中在內(nèi)的各種疾病的發(fā)病機(jī)制［20］。洞察他們的相互作用和機(jī)制對找到更有效的腦缺血治療方法很重要。

缺血核心區(qū)由于MCA 血流完全堵塞致使腦細(xì)胞死亡。而外圍的缺血半暗區(qū)被定義為具有形態(tài)完整性和保持能量代謝而氧、葡萄糖缺失的腦組織，是介于梗死灶和正常組織之間的移行區(qū)域，由于側(cè)支循環(huán)存在，仍可獲得部分血液能量供給，因而具有恢復(fù)能力［21］。研究觀察，腦I/R 后缺血半暗區(qū)可持續(xù)超過12 h，這為搶救提供了潛在機(jī)會［22］。與本文的研究結(jié)果類似，從腦缺血發(fā)生至4 d腦梗死體積持續(xù)擴(kuò)大，表明在此期間的細(xì)胞調(diào)控都具有一定意義，并且提示早期12 h前及時治療對減少梗死體積的效果更佳。而自噬是一種可逆的細(xì)胞死亡形式，可以使細(xì)胞重生，其與壞死和凋亡使細(xì)胞最終走向死亡的命運(yùn)不同，所以缺血半暗區(qū)的自噬是腦卒中具有吸引力的治療靶點(diǎn)。在Western blot技術(shù)中膜型LC3-II與胞漿型LC3-I 比值的大小可評估自噬水平的高低，LC3被作為自噬體形成的標(biāo)志［23］，C-caspase-3是凋亡啟動的必要條件［24］，因此，本研究中 LC3 和 C-caspase-3分別作為檢測自噬和凋亡水平的金指標(biāo)。

Figure 6. Expression level of LC3 detected by immunofluorescence（A）and TUNEL staining（B）in the penumbra after cerebral ischemia-reperfusion. Autophagic cells were stained with LC3 antibody（red），apoptotic cells were TUNEL staining positive（green），and cell nuclei were visualized by DAPI（blue）. The scale bar=10 μm. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs 6 h；△P＜0.05 vs 12 h；▲P＜0.05 vs 2 d；☆P＜0.05 vs 7 d.圖6 腦缺血再灌注半暗區(qū)LC3表達(dá)水平和TUNEL染色

我們的結(jié)果顯示，腦梗死體積在大鼠腦I/R 后12 h 內(nèi)快速擴(kuò)大，同時神經(jīng)功能缺損也逐漸加重，顯示神經(jīng)缺陷與腦梗死體積的擴(kuò)大相一致。Li等［25］最近的研究結(jié)果得出了類似的結(jié)論，腦缺血發(fā)生后神經(jīng)損傷評分和腦梗死體積均急劇增加。另外，在此階段，半暗區(qū)中LC3 和C-caspase-3 的表達(dá)水平逐漸增加，并且在12 h達(dá)到最大。如上所述，同樣得到自噬和凋亡相關(guān)蛋白Beclin-1、Bcl-2 和Bax 的數(shù)據(jù)支持［26］。因此，可以通過調(diào)節(jié)自噬和凋亡的活化程度、抑制梗死體積的擴(kuò)張和促進(jìn)急性期的細(xì)胞存活來提供神經(jīng)保護(hù)功能。之后，亞急性期腦梗死體積從12 h 逐漸增大至28 d，同時，神經(jīng)感覺和運(yùn)動功能缺陷也顯著增加。然而，半暗區(qū)的自噬和凋亡在這個階段顯示出不同的變化：LC3 的表達(dá)水平在12 h 后持續(xù)下降并在2 d 降至非常低的水平，C-caspase-3 的表達(dá)水平也降低，但是降低相對自噬較輕并仍然維持在高水平，表明自噬表達(dá)的下降可能是導(dǎo)致神經(jīng)功能缺陷增加的主要原因。這一結(jié)果實(shí)際上與以前的研究不一致［27］，其顯示自噬抑制在腦缺血中具有神經(jīng)保護(hù)作用。分析不難發(fā)現(xiàn)，不同的動物模型、干預(yù)措施以及時點(diǎn)可能會導(dǎo)致相反的結(jié)果。驚訝的是，腦I/R 損傷2 d 后LC3 表達(dá)水平突然改善，自噬明顯增加。相反，C-caspase-3 表達(dá)水平持續(xù)快速下降至28 d。這些結(jié)果提示2～28 d 亞急性期可能出現(xiàn)細(xì)胞凋亡向自噬的轉(zhuǎn)換，這種轉(zhuǎn)換在腦I/R 病理生理過程中發(fā)揮重要功能。因此，對于自噬和凋亡在大鼠腦缺血中的研究應(yīng)該結(jié)合不同時期的特征時點(diǎn)進(jìn)行綜合有效的分析救治，不論在時間上還是不同細(xì)胞分子信號機(jī)制的聯(lián)系上。

有研究指出，自噬和凋亡的激活機(jī)制不僅發(fā)生在神經(jīng)元中［28］，而且在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中［29］，甚至二者發(fā)生在同一個細(xì)胞中［30］。Xu 等［31］通過免疫熒光檢測腦I/R 后6 h 星形膠質(zhì)細(xì)胞的自噬顯著增加，但在缺血后12～24 h 其表現(xiàn)出凋亡和壞死形態(tài)特征。因此，我們預(yù)測在本研究中2 d后從細(xì)胞凋亡到自噬的轉(zhuǎn)變主要發(fā)生在神經(jīng)元而不是星形膠質(zhì)細(xì)胞中，并且大多研究結(jié)果也指示自噬多發(fā)生在神經(jīng)元中［32］。此外，在腦I/R 后4 d 梗死體積已達(dá)最大值，但LC3 和C-caspase-3 的表達(dá)仍可持續(xù)檢測，表明梗死體積不能完全代表壞死［33］，因為TTC 染色標(biāo)記的是組織中線粒體的活性，在半暗區(qū)中反而自噬和凋亡對細(xì)胞的存活有較大影響［34］。

綜上所述，本研究表明腦缺血半暗區(qū)的自噬和凋亡在腦I/R 后表現(xiàn)出不同的時間變化，可以將急性期（6 和12 h）及亞急性期（2、7 和28 d）作為腦I/R 大鼠模型中自噬與凋亡研究的特征時點(diǎn)。本實(shí)驗為研究者進(jìn)一步的機(jī)制研究提供了較為可靠的時點(diǎn)選擇。重要的是，我們發(fā)現(xiàn)在大鼠腦缺血亞急性期可能存在從細(xì)胞凋亡到自噬的轉(zhuǎn)換，半暗區(qū)的細(xì)胞凋亡水平顯著降低，但自噬仍維持在高水平，二者存在一定的相互作用，因此我們推測減弱過度自噬可能是此階段腦卒中治療的優(yōu)先任務(wù)。