明 輝，李 浩，徐 婷

（四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川宜賓644000）

0 引言

溶菌酶是一種對(duì)人體無(wú)毒無(wú)害的天然蛋白，可以作為一種抗菌蛋白，殺滅部分革蘭氏陽(yáng)性菌，因此被廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域，作為食品防腐劑應(yīng)用于食品保鮮、食品貯藏[1-2]等方面。由于其抗菌和抗生素，溶菌酶還可以提高免疫力和治療多發(fā)炎癥[3]。在禽類的飼料中添加少量溶菌酶，能夠抑菌防腐、延長(zhǎng)飼料的貯存期，還可以提高禽類的抗病能力、存活能力和生長(zhǎng)速度[4-5]。在包裝行業(yè)中，用經(jīng)溶菌酶處理的包裝紙包裝饅頭時(shí)，可以使其延長(zhǎng)1周而不變味。因此，食品工業(yè)、動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)和疾病防治等都需要大量的溶菌酶。據(jù)估計(jì)，全世界每年商業(yè)使用溶菌酶超過(guò)了100 t。而高純度、高活性溶菌酶一直是近年來(lái)食品與醫(yī)院界的研究熱點(diǎn)。

目前，雞蛋清溶菌酶分離純化的技術(shù)主要有兩大類，第一類是放大法，主要是采用超濾法、沉淀法、鹽析、離子交換法等；第二類為實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，主要有親和層析、色譜法、反膠束等。對(duì)雞蛋清溶菌酶分離純化技術(shù)近年來(lái)取得的成就進(jìn)行綜述。

1 超濾法

1.1 超濾原理

超濾法是利用膜兩側(cè)壓力差，通過(guò)不同超濾膜的孔徑，將分子量不同的混合物進(jìn)行分離，使小分子通過(guò)膜，而大分子被截留，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)酶的純化[6]。該方法操作簡(jiǎn)單方便，且酶不容易失活，但也存在膜易堵塞、操作時(shí)間較長(zhǎng)等缺點(diǎn)。

1.2 超濾的基本過(guò)程

應(yīng)用超濾法分離純化雞蛋清溶菌酶，一般采用兩步法，第一步將料液經(jīng)過(guò)50kDa的PES膜進(jìn)行超濾，主要除去大部分雜蛋白，第二步再進(jìn)行30 kDa PES膜超濾。由于超濾法分離蛋白質(zhì)受操作條件和物理化學(xué)條件的強(qiáng)烈影響，因此需要非常精確的過(guò)程才能有效分離蛋白質(zhì)，為了確定最佳的條件，可以通過(guò)改變壓力、攪拌速度、pH值等工藝參數(shù)。

1.3 影響因素

1.3.1 pH值

研究發(fā)現(xiàn)不同的pH值隨時(shí)間變化對(duì)分離特性有很大影響。Datta D等人[7]選擇3種不同的pH值下進(jìn)行檢測(cè)。一種是低于卵清蛋白的等電點(diǎn)2.5，一種是高于卵清蛋白的等電點(diǎn)5.5；另一種是在卵清蛋白的等電點(diǎn)，即4.5。膜通量在pH值5.5時(shí)最小，由于蛋清中大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在4.5～5.5。因此，蛋白質(zhì)在pH值5.5時(shí)的總電荷是可以忽略的。又由于膜表面沉積的蛋白質(zhì)之間并無(wú)靜電斥力，沉積層變密集，濃差極化現(xiàn)象影響變大[8]，分子簇形成可能會(huì)阻礙溶質(zhì)分子的滲透[9]，進(jìn)而造成膜通量減少。在pH值2.5的條件下，偏離了雞蛋清中的卵清蛋白等電點(diǎn)，使得卵清蛋白帶正電，而蛋清中大多數(shù)蛋白帶正電，保留了在表面的蛋白質(zhì)分子之間的靜電排斥作用，滲透量會(huì)很高，靜電斥力會(huì)降低濃差極化，降低膜阻力，從而產(chǎn)生更高的膜通量。在pH值4.5時(shí)，為雞蛋清卵清蛋白的等電點(diǎn)，溶液中蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力接近于零，蛋白質(zhì)分子處于離散化，在膜表面形成的凝膠導(dǎo)致蛋白質(zhì)的最大析出，從而使得膜通量較小，滲透濃度較低[10]。

1.3.2 跨膜壓力

壓力是影響膜通量的重要因素，由于施加在膜表面的驅(qū)動(dòng)力變大，膜通量則會(huì)隨著操作壓力的增加而增大。隨著時(shí)間的推移，滲透通量先會(huì)迅速下降，然后逐漸下降，最終放平緩。在低壓力下，膜通量的下降速率會(huì)更快，這可能是由于膜表面的濃差極化形成了凝膠層，對(duì)膜通量產(chǎn)生了阻力。隨著驅(qū)動(dòng)力的減小，濃差極化產(chǎn)生的凝膠層的厚度增加的更快。然而，壓力過(guò)大也會(huì)加速某些組分在膜中的沉積，造成膜孔減少甚至堵塞，最終使得膜通量和蛋白質(zhì)得率降低[11]。

1.3.3 攪拌速度

不攪拌的情況下，蛋白質(zhì)容易沉積在膜表面，導(dǎo)致濃差極化增大，膜通量和蛋白質(zhì)回收率降低。而研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)增加攪拌，膜通量隨著攪拌次數(shù)的增加而增加，蛋白的回收率也逐漸提高，這是由于帶有高剪切裝置特性的膜表面的渦流增強(qiáng)。高通量可能的原因是攪拌時(shí)，靠近膜的進(jìn)料也會(huì)旋轉(zhuǎn)，并將沉積的溶質(zhì)從膜表面給掃走，減低了濃差極化，同時(shí)增加了滲透速率。Datt D等人[7]研究表明，攪拌速率50～200 rpm，蛋白回收率從82.3%提高到了98.7%。

1.3.4 進(jìn)料濃度

不同的進(jìn)料濃度對(duì)滲透通量有不同的影響。初始濃度越高，通量下降的速率也會(huì)越快。并且容易形成顯著的膜污染，這是由于特定的膜-溶質(zhì)相互作用引起的[7]，而這些不溶物將會(huì)沉積在膜表面造成膜堵塞，從而導(dǎo)致膜通量的下降[12]。不管是表面沉積還是膜污染，膜的固有阻力都會(huì)發(fā)生變化，這是由于物理化學(xué)的相互作用。進(jìn)料濃度對(duì)分離特性也會(huì)產(chǎn)生影響，雖然低進(jìn)料濃度可以提高滲透速率，但滲透液中總蛋白和單個(gè)蛋白濃度會(huì)顯著降低，這主要是由于水相與蛋白質(zhì)分子的滲透。通過(guò)對(duì)進(jìn)料濃度進(jìn)行優(yōu)化，可以使?jié)B透通量和滲透蛋白濃度保持在滿意的范圍內(nèi)。

2 食鹽直接結(jié)晶法

2.1 結(jié)晶的基本原理

結(jié)晶是物質(zhì)在過(guò)飽和度或過(guò)冷度的驅(qū)動(dòng)下從蒸汽、溶液或熔融體中以晶體形態(tài)析出的過(guò)程。該過(guò)程包括形核和晶體生長(zhǎng)。目前，主要的結(jié)晶方法有批量結(jié)晶[13]、液-液擴(kuò)散結(jié)晶[14]、蒸汽擴(kuò)散結(jié)晶[15]和透析結(jié)晶[16]。該方法操作簡(jiǎn)單，但花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，短則數(shù)天、數(shù)周，長(zhǎng)則數(shù)月。

2.2 結(jié)晶的基本過(guò)程

雞蛋清溶菌酶結(jié)晶，是通過(guò)溶菌酶具有耐熱耐酸性，且在鹽溶液中易析出，通過(guò)調(diào)節(jié)工藝參數(shù)，讓蛋白溶液達(dá)到過(guò)飽和，從而使得溶菌酶形成晶體，并從溶液中析出來(lái)。結(jié)晶法是雞蛋清溶菌酶分離純化最為常用的方法，該方法先利用等電點(diǎn)沉淀，調(diào)節(jié)蛋清的pH值到4.5，再利用溶菌酶的熱變性加熱數(shù)分鐘，除去大量的雜蛋白后，加入NaCl作為沉淀劑，調(diào)節(jié)pH值至溶菌酶的等電點(diǎn)10.7。再加入溶菌酶晶種，進(jìn)行誘導(dǎo)結(jié)晶。低溫下放置大概1周，觀察到析出大量溶菌酶晶體，從而實(shí)現(xiàn)與其他雜蛋白的分離。若要獲得純度更高的溶菌酶，可通過(guò)上述方法重復(fù)結(jié)晶。但蛋白質(zhì)晶體的形成，受到結(jié)晶條件的影響，結(jié)晶過(guò)程只要有細(xì)微偏差，晶體的質(zhì)量和得率都會(huì)受到很大影響。因此，為了得到高質(zhì)量的晶體和更高的產(chǎn)率，就有必要確定最佳的結(jié)晶條件。

2.3 影響因素

2.3.1 鹽濃度

研究表明，通過(guò)調(diào)節(jié)不同的鹽濃度，得到的晶體質(zhì)量有明顯差異，隨著鹽濃度的增加，溶菌酶得率會(huì)增加，這是因?yàn)辂}濃度的增加，增大了溶液的過(guò)飽和度，從而影響晶體的數(shù)量和質(zhì)量，但是隨著鹽濃度的增加，會(huì)在溶液中觀察到不規(guī)則晶體和海膽或球粒隕石的存在，過(guò)多的鹽會(huì)導(dǎo)致晶體質(zhì)量明顯下降。

2.3.2 溫度

不同的蛋白質(zhì)需要的結(jié)晶溫度不一樣[17]，由于溶菌酶的溶解度隨著溫度的升高而逐漸增大，故溶菌酶結(jié)晶在低溫下更易析出。然而，逐漸變化的溫度能使溶菌酶形成的晶體形貌較好，在恒溫下的晶體質(zhì)量與在逐漸變化的溫度相比，會(huì)出現(xiàn)更大的缺陷，如出現(xiàn)裂紋、易破裂等，并且純度較低[18]，故結(jié)晶最好在低溫下，且溫度逐漸變化下最好，這是因?yàn)榫w在形核區(qū)形核，在亞穩(wěn)區(qū)生長(zhǎng)。通過(guò)控制溫度的變化，讓晶體達(dá)到理想生長(zhǎng)區(qū)域，并且在低溫下溶菌酶能保持更好的活性。

2.3.3 pH值

通常情況下，晶體會(huì)在靠近蛋白溶液的等電點(diǎn)附近析出；相反，遠(yuǎn)離等電點(diǎn)則不利。這是由于溶液pH值的改變會(huì)引起蛋白質(zhì)分子所帶電荷的改變，從而影響蛋白質(zhì)溶解度的改變[19]。而蛋清中的蛋白質(zhì)大多等電點(diǎn)都在4.5～5.5，而溶菌酶的等電點(diǎn)為10.5～11.0，故先調(diào)節(jié)其他雜蛋白的pH值，讓其析出。進(jìn)行離心分離之后，再調(diào)節(jié)溶菌酶的等電點(diǎn)。

3 離子交換法

3.1 離子交換法的原理

離子交換法是應(yīng)用離子交換劑分離蛋白溶液中的蛋白質(zhì)，由于蛋白質(zhì)分子帶有不同的電荷，其與離子交換劑的基團(tuán)有不同的強(qiáng)弱結(jié)合能力，從而能夠?qū)崿F(xiàn)不同蛋白的分離純化。根據(jù)蛋白溶液及其分離的要求，選擇合適的離子交換劑。

3.2 離子交換的過(guò)程

由于溶菌酶是堿性蛋白酶，因此一般使用弱酸性陽(yáng)離子樹(shù)脂作為離子交換劑。這是由于弱酸性陽(yáng)離子樹(shù)脂能夠與蛋白溶液中的陽(yáng)離子進(jìn)行結(jié)合吸附，從而產(chǎn)生離子交換作用。使用之前，對(duì)購(gòu)買的樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理，即用3倍體積的95%乙醇浸泡24 h，然后對(duì)其中的無(wú)機(jī)雜質(zhì)用酸洗滌，有機(jī)雜質(zhì)用堿除去，洗至中性即可。再用4～5倍體積的蒸餾水中和樹(shù)脂[20]。將處理好的樹(shù)脂小心灌入柱中，再將蛋清液加入樹(shù)脂中使其充分吸附，并在4℃下緩慢攪拌，以達(dá)到吸附平衡，吸附完成后，通過(guò)離心去除上清液，收集樹(shù)脂，然后用蒸餾水進(jìn)行洗脫，離心除去上清液，再加入鹽溶液，攪拌混合后，進(jìn)行洗脫、離心，收集上清液。該方法具有樣品處理量大、回收率高、活性保持良好、分離周期相對(duì)較短、價(jià)格低廉、可自動(dòng)化連續(xù)生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，是目前分離純化溶菌酶的常用方法。

3.3 影響因素

3.3.1 離子交換劑的類型

姜馗[21]以D152型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂為介質(zhì)，通過(guò)對(duì)一系列參數(shù)的優(yōu)化，得到的溶菌酶回收率為86.6%，活性為20 000 U/mg，洗脫下來(lái)的溶菌酶純度達(dá)到了100%。李欣[22]用DEAE-纖維素陰離子交換層析法分離雞蛋清溶菌酶，得到的溶菌酶收率為60%，酶活為15 000 U/mg，溶菌酶純度超過(guò)99.5%。李宗孝等人[23]采用724型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂提取溶菌酶，選用1%的H2SO4溶液洗脫，溶菌酶收率為14%。宋宏新等人[24]采用724型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂提取蛋清溶菌酶，分別用了動(dòng)態(tài)交換法和靜態(tài)交換法，吸附率分別達(dá)到了83.5%，74.8%，其回收率達(dá)100%。

3.3.2 溫度

通過(guò)分析不同溫度條件下溶菌酶的吸附情況，表明隨著溫度的增加吸附量會(huì)明顯增加。低溫不利于溶菌酶的吸附，在12℃以上的溫度時(shí)吸附量的增加趨勢(shì)會(huì)逐漸變緩[21]。

3.3.3 pH值

通過(guò)調(diào)節(jié)pH值范圍在4～10時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同pH值時(shí)的樹(shù)脂對(duì)蛋清溶液進(jìn)行吸附所得到的溶菌酶其純度都較高。研究還發(fā)現(xiàn)，不同的pH值對(duì)溶菌酶的收率和活力會(huì)有較大的影響，在pH值接近中性時(shí)比pH值偏酸或偏堿時(shí)得到的溶菌酶收率和活性要好[25]。這是由于溶菌酶是堿性蛋白，其等電點(diǎn)在10.7左右，故在偏酸性條件下較穩(wěn)定。

3.3.4 蛋白質(zhì)濃度

研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)蛋清稀釋不同的倍數(shù)，溶菌酶的回收率會(huì)不同。當(dāng)?shù)扒逡合♂?倍時(shí)，回收率為82.2%，當(dāng)?shù)扒逡合♂?倍時(shí)回收率為84%[21]。當(dāng)?shù)扒逑♂?倍或者2倍時(shí)，洗脫下來(lái)的所獲得的蛋白純度都較高，基本為溶菌酶，然而隨著濃度的逐漸降低，洗脫液所得到的溶菌酶純度就會(huì)變低，這是由于樹(shù)脂會(huì)吸附其他雜蛋白，破壞了樹(shù)脂與溶菌酶的專一性吸附。由此表明，當(dāng)?shù)扒鍧舛冗m中時(shí)，樹(shù)脂所吸附到的溶菌酶的回收率就會(huì)增加。

4 親和色譜法

4.1 親和色譜法的原理

親和色譜法通常是色譜法中選擇最高的一種，利用酶和底物，或者抗原抗體的特異性相結(jié)合，將特異性結(jié)合的一方作為固定相，利用與固定相不同的親和度進(jìn)行分離，并選擇性地吸附物質(zhì)，再通過(guò)洗脫分析所需物質(zhì)[26]。

4.2 親和色譜法的過(guò)程

通過(guò)制備親和層析介質(zhì)作為填料，然后進(jìn)行平衡，將預(yù)處理的蛋清進(jìn)行裝柱，進(jìn)行專一性親和吸附，吸附后進(jìn)行洗脫。在整個(gè)洗脫過(guò)程中有一個(gè)單一的色譜峰，表明在流動(dòng)緩沖液中能有效洗脫被吸附的蛋白質(zhì)[27]。該方法操作簡(jiǎn)單、選擇性高、分離出的蛋白能夠保持較好的活性等。

4.3 影響因素

4.3.1 pH值

和離子交換法類似，色譜法也同樣是在pH值偏中性時(shí)，溶菌酶的吸附量最大。在偏酸和偏堿性pH值條件下，溶菌酶的吸附明顯降低。表明介質(zhì)pH值對(duì)溶菌酶的吸附平衡有重要影響。pH值為7時(shí)，介質(zhì)與溶菌酶直接存在優(yōu)先的相互作用。這可能是離子交換和疏水相互作用的結(jié)果[28-29]。

4.3.2 鹽濃度

樹(shù)脂對(duì)溶菌酶的吸附量會(huì)隨著鹽濃度的增加而逐漸降低。這是由于隨著離子強(qiáng)度的增加，介質(zhì)對(duì)溶菌酶的吸附能力降低，這可能是由于介質(zhì)與溶菌酶之間的靜電相互作用減弱導(dǎo)致的[30]。一般選用的介質(zhì)都含有疏水基團(tuán)和帶電基團(tuán)，在吸附的整個(gè)過(guò)程中，這2種力就會(huì)相互結(jié)合。

5 萃取法

5.1 萃取原理

萃取法是通常分離液-液混合物的方法，是根據(jù)溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑里溶解度或分配系數(shù)的不同，使得溶質(zhì)從一種溶劑內(nèi)轉(zhuǎn)移到另外一種溶劑里提取出來(lái)的方法[31]。

5.2 萃取過(guò)程

萃取過(guò)程一般分為3步，即萃取、洗滌和反萃取。首先，將雞蛋清預(yù)處理，然后與萃取劑進(jìn)行混合，充分振蕩，完成萃取。經(jīng)過(guò)離心將得到的液體相再加入鹽溶液，進(jìn)行反萃取操作，之后離心、脫鹽、冷凍干燥得到產(chǎn)品。

5.3 影響因素

5.3.1 pH值

考慮到堿性條件可能會(huì)破壞溶菌酶的活性，故通過(guò)調(diào)節(jié)萃取體系的pH值2～9，發(fā)現(xiàn)pH值和離子強(qiáng)度的變化對(duì)萃取效率沒(méi)有顯著影響[32]?？赡苁怯捎谌芫杆鶐щ姾稍谒芯康膒H值范圍內(nèi)沒(méi)有發(fā)生變化，沒(méi)有靜電相互作用。因此，pH值和離子強(qiáng)度對(duì)萃取的影響可忽略不計(jì)。

5.3.2 萃取劑用量

隨著萃取劑用量的增加，萃取率先是逐漸增加，之后會(huì)略有下降，這可能是由于萃取劑和溶菌酶在頂部的相形成了聚集體。隨著萃取劑用量的增加，頂層相的體積相應(yīng)增大，導(dǎo)致體系的相形成能力增強(qiáng)[32]。因此，聚集體會(huì)將更多的溶菌酶轉(zhuǎn)移到頂層。當(dāng)萃取劑用量過(guò)多時(shí)，萃取的能力會(huì)受到抑制，這可能是由于萃取劑的相空間有限，趨于飽和，過(guò)量的萃取劑溶劑在水相中，導(dǎo)致萃取效率下降。

5.3.3 鹽濃度

鹽濃度也是影響萃取過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵因素。鹽濃度提高，萃取率會(huì)得到明顯的提高，這可能是由于鹽的濃度增加，鹽析效果增加，疏水性增加，導(dǎo)致溶菌酶在低相中的溶解度降低。使得更多的溶菌酶遷移到了頂層。但當(dāng)鹽濃度過(guò)多時(shí)，萃取率開(kāi)始下降，可能的原因是隨著鹽濃度的進(jìn)一步增加，頂部相的含水量被拖入到底部相，因此頂部相體積急劇減小，溶菌酶下降[31]。

6 其他方法

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究者通過(guò)合成吸附劑來(lái)分離純化溶菌酶，如Wang X等人[33]使用了分子印跡技術(shù)對(duì)溶菌酶進(jìn)行分離純化，通過(guò)以溶菌酶為模板，丙烯酰胺和甲基丙烯酸為功能單體，制備了Lys-MIPs[34]，然后通過(guò)Lys-MIPs柱，從蛋清中分離出溶菌酶。Chiu H T等人[35]報(bào)道了一種離子交換納米纖維膜，通過(guò)膜和攪拌細(xì)胞反應(yīng)器直接從雞蛋清中純化溶菌酶。蛋白回收率為22.3%，再經(jīng)純化后回收率達(dá)80.5%。Cheng C Y等人[36]研究了一種環(huán)保型聚乳酸稻殼灰混合基質(zhì)膜用于純化雞蛋清溶菌酶，溶菌酶的回收率為70%，純度接近100%。Luo R P等人[37]采用磁性納米粒從新鮮蛋清中分離出溶菌酶，并考查了酶濃度、吸附時(shí)間、pH值、離子強(qiáng)度等因素，其含量達(dá)113±4.2 mg/g，酶活達(dá)16 370±46 U/mg。

7 結(jié)語(yǔ)

溶菌酶的用途十分廣泛，尤其是高純度、高活性的溶菌酶，需求量越來(lái)越大，其分離純化的工藝一直是研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。近年來(lái)，雞蛋清溶菌酶的分離純化技術(shù)發(fā)展迅速，其方法也是多種多樣，可根據(jù)所需的要求采用不同的分離純化手段，以獲得更高質(zhì)量的溶菌酶。單一的分離純化方法，可能存在回收率低、純度不高等情況，因而更多的研究者會(huì)選用多種方法結(jié)合，如Ji S等人[38]通過(guò)連續(xù)使用沉淀法，后又經(jīng)離子交換、超濾等方法，對(duì)蛋清中的5種主要蛋白進(jìn)行了分離，得到溶菌酶的純度高于90%，高于77%。又如，Chen C等人[39]開(kāi)發(fā)了親和膜色譜和染料配體色譜法，用于溶菌酶的純化，其在規(guī)?；纳a(chǎn)中，取得了高效益，在工業(yè)上得到了廣泛的應(yīng)用[40]。因此，研究者可以充分利用溶菌酶的耐熱性、耐酸性、溶劑性等特點(diǎn)，通過(guò)改進(jìn)分離純化的手段，合理地將結(jié)晶法、色譜法、萃取法等結(jié)合使用，以達(dá)到有效的回收率和純度。