黃佳雯，梁佳威，顏亮，鄭楓

（1.中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇南京 211198；2，南京卡文迪許生物工程技術(shù)有限公司，江蘇南京 210033）

伊格列凈（Ipraliflozin）是C-芳基葡糖苷類結(jié)構(gòu)的高選擇性人體鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（SGLT2）口服活性抑制劑，通過(guò)選擇性的抑制腎臟近曲小管上皮細(xì)胞膜管腔側(cè)的鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(SGLT2)，減少葡萄糖重吸收并促進(jìn)尿糖排泄，進(jìn)而降低血糖，同時(shí)可減重和降壓[1]。該藥已于2019 年在美國(guó)上市，但未在國(guó)內(nèi)上市，目前未見各國(guó)藥典對(duì)本品的收載及進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)[2]。本研究旨在為仿制藥伊格列凈的含量測(cè)定提供科學(xué)性的方法依據(jù)及分析技術(shù)，保障藥品的安全性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1200，Agilent 色譜工作站。

伊格列凈L-脯氨酸（自制對(duì)照品，99.7%）、雜質(zhì)IMP01（自制對(duì)照品，99.5%）、雜質(zhì)IMP02（自制對(duì)照品，99.9%）、雜質(zhì)IMP03（自制對(duì)照品，99.0%）、雜質(zhì)IMP04（自制對(duì)照品，99.5%）、雜質(zhì)IMP05（自制對(duì)照品，99.5%）、雜質(zhì)IMP06（自制對(duì)照品，99.9%）、雜質(zhì)IMP07（自制對(duì)照品，99.7%）、雜質(zhì)IMP08（自制對(duì)照品，99.8%）、磷酸（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、甲醇（色譜純，默克）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

儀器:高效液相色譜儀;色譜柱：Waters Symmetry Shield RP18（3.5μm，3.0×50mm）；流動(dòng)相：0.05%磷酸-甲醇(65:35)；檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm;流速:1.2mL/min；進(jìn)樣體積:20μL。

系統(tǒng)適用性:取伊格列凈適量，用流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成每1mL 中約含伊格列凈(C21H21FO5S)50μg 的溶液,在擬定色譜條件下，精密量取20μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖色譜柱的理論塔板數(shù)大于2000，拖尾因子小于2.0。

具體試驗(yàn)操作：取伊格列凈20 片，精密稱定，研細(xì),精密稱取適量（約相當(dāng)于伊格列凈25mg）,置50mL 量瓶中,加流動(dòng)相適量,超聲10min 使伊格列凈L-脯氨酸溶解,放冷,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻，離心，取上清液濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5mL,置50mL 量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻,作為供試溶液，精密量取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取伊格列凈L-脯氨酸對(duì)照品,精密稱定,加流動(dòng)相溶解并釋制成每1mL 中約含伊格列凈（C21H21FO5S）50μg的溶液，同法測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，并將結(jié)果乘以0.7784,即得。

試驗(yàn)結(jié)果判定:含伊格列凈（C21H21FO5S）應(yīng)為標(biāo)示量的90.0%～110.0%。

2.2 輔料干擾試驗(yàn)

考察在此色譜條件下空白輔料對(duì)檢測(cè)的影響。按處方量分別稱取空白輔料及伊格列凈L-脯氨酸適量,用流動(dòng)相制成空白輔料溶液、原料溶液及原輔料混合溶液，精密量取20μL,注入液相色譜儀，記錄色譜圖。測(cè)定結(jié)果見表1。結(jié)果表明，空白輔料不干擾檢測(cè)。

表1 輔料干擾試驗(yàn)結(jié)果

2.3 專屬性試驗(yàn)

取伊格列凈L-脯氨酸樣品及伊格列凈中可能存在的雜質(zhì)IMP01、IMP02、IMP03、IMP04、IMP05、IMP06、IMP07、IMP08 適量，用甲醇溶解并用流動(dòng)相定量稀釋制成每1mL 中約50μg 的溶液分別量取20μL,注入色譜儀，記錄色譜圖；并將伊格列凈L-脯氨酸溶液與各雜質(zhì)溶液混合進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果見表2 和圖1。

表2 專屬性試驗(yàn)結(jié)果

圖1 伊格列凈L-脯氨酸專屬性結(jié)果

結(jié)果表明：在擬定色譜條件下，伊格列凈L-脯氨酸主峰與雜質(zhì)分離良好。雜質(zhì)IMP01、IMP03、IMP04 極性與伊格列凈L-脯氨酸差異較大，在該條件不能洗脫出來(lái)，并不干擾伊格列凈L-脯氨酸測(cè)定。

2.4 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

取伊格列凈L-脯氨酸對(duì)照品溶液，按照擬定色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖。計(jì)算結(jié)果得到連續(xù)6 次進(jìn)樣伊格列凈L-脯氨酸峰面積的RSD 為0.2%，表明進(jìn)樣精密度良好。

2.5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取伊格列凈L-脯氨酸對(duì)照品溶液，按照擬定色譜條件，在0h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h進(jìn)樣，記錄色譜圖。計(jì)算結(jié)果得到0～24h 內(nèi)伊格列凈L-脯氨酸峰面積的RSD 為0.1%，表明伊格列凈L-脯氨酸對(duì)照品溶液在24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

取伊格列凈L-脯氨酸片劑樣品適量，用流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成每1mL 約含伊格列凈 (C21H21FO5S)50μg 的溶液。按照擬定色譜條件，在0h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h 進(jìn)樣。計(jì)算結(jié)果得到0～24h 內(nèi)伊格列凈L-脯氨酸峰面積的RSD 為0.2%，表明伊格列凈L-脯氨酸片劑樣品溶液在24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 線性試驗(yàn)

取伊格列凈L-脯氨酸對(duì)照品適量，用流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成每1mL 約含伊格列凈(C21H21FO5S)10～100μg 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照色譜條件，分別精密量取20μL,注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積A 為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，并計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果見表3 和圖2。結(jié)果表明伊格列凈在10.06～100.56μg/mL 范圍峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

圖2 伊格列凈L-脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 線性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

精密稱取伊格列凈L-脯氨酸對(duì)照品適量，約含伊格列凈(C21H21FO5S) 分別為40mg,50mg,60mg 置100mL 量瓶中，再分別加入空白輔料307mg,加流動(dòng)相適量，超聲10 min 使伊格列凈溶解并稀釋至刻度，搖勻,濾過(guò),精密移取續(xù)濾液5mL 置50mL 容量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻,作為供試溶液(每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)配置3 份樣品)。另取伊格列凈L-脯氨酸對(duì)照品適量,定量制成每1mL 中約含伊格列凈 (C21H21FO5S)50μg的溶液作為對(duì)照溶液。照含量測(cè)定項(xiàng)下的方法操作,記錄色譜圖,計(jì)算測(cè)得量，根據(jù)測(cè)得量和加入量計(jì)算回收率。結(jié)果表明伊格列凈L-脯氨酸的總平均回收率為99.9%，RSD 為0.3%。數(shù)據(jù)見表4。

表4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.8 耐用性試驗(yàn)

取伊格列凈L-脯氨酸工作對(duì)照品適量，用流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成每1mL 約含伊格列凈 (C21H21FO5S)50μg 的溶液，作為對(duì)照品溶液；另取伊格列凈L-脯氨酸樣品適量，用流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成每1mL 約含伊格列凈(C21H21FO5S)50μg 的溶液，作為供試品溶液。在擬定色譜條件基礎(chǔ)上，分別考察柱溫±5°C,流動(dòng)相比例±5%,流速±0.2mL/min,選用不同色譜柱對(duì)檢測(cè)的影響。結(jié)果表明，各條件下伊格列凈的精密度均符合要求，RSD ≤5%。

2.9 樣品測(cè)定

取三批伊格列凈片，按照“2.1”項(xiàng)下配制供試品溶液，按照擬定色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，測(cè)定伊格列凈量。結(jié)果表明：三批供試品伊格列凈含量均為標(biāo)示量的90.0%～110.0%。

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

根據(jù)伊格列凈L-脯氨酸的理化性質(zhì)，經(jīng)優(yōu)化后篩選出專屬性佳，精密度及準(zhǔn)確度均符合規(guī)定且簡(jiǎn)便快捷的等度條件，作為含量檢測(cè)方法。

有機(jī)相的比例對(duì)分離度影響較大，為了保證檢測(cè)條件的適用性，且為了保證藥品的質(zhì)量及使用安全，最終采用流動(dòng)相為0.05%磷酸-甲醇(65∶35) 方法本品進(jìn)行含量的檢查。對(duì)比了Waters Symmetry Shield RP18 柱與Waters Symmetry C18 柱兩根50mm 短柱，兩種色譜柱均適合，主峰拖尾因子都在1.2 左右，就理論板數(shù)比較，Waters Symmetry Shield RP18 柱略優(yōu)。選擇以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，以0.05%磷酸-甲醇(65∶35)為流動(dòng)相，能有效的檢測(cè)本品含量。

3.2 超聲時(shí)間的選擇

取伊格列凈片，精密稱定，研細(xì),精密稱取適量（約相當(dāng)于伊格列凈25mg）,置50mL 量瓶中,加流動(dòng)相適量，分別超聲1min、2min、5min、10min、15min 后，放冷，用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻，離心，取上清液濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5mL置50mL 量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻,作為供試溶液。精密量取20μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取伊格列凈L-脯氨酸對(duì)照品,精密稱定，用流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成每1mL 中約含伊格列凈（C21H21FO5S）50μg 的溶液，同法測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算,即得。結(jié)果見表5。

表5 超聲時(shí)間對(duì)含量測(cè)定的影響

結(jié)論：超聲2～5min 樣品即可提取完全。為了確保每次提取完全，因此，我們選擇超聲10min 做為溶劑提取時(shí)間。

3.3 濾膜的選擇

樣品溶液：取伊格列凈片，精密稱定，研細(xì),精密稱取適量（約相當(dāng)于伊格列凈25mg）,置50mL 量瓶中,加流動(dòng)相適量，超聲10min 后，冷卻至室溫，用流動(dòng)相定容至刻度搖勻。

離心：取上述樣品溶液離心后取上層溶液。

取上述樣品溶液分別用美國(guó)PALL 的有機(jī)濾膜過(guò)濾，棄去初濾液1mL、3mL、5mL，取續(xù)濾液，作為樣品PALL-棄1mL、PALL-棄3mL、PALL-棄5mL。

取上述樣品溶液分別用江蘇酷拓的有機(jī)濾膜過(guò)濾，棄去初濾液1mL、3mL、5mL，取續(xù)濾液，作為樣品酷拓-棄1mL、酷拓-棄3mL、酷拓-棄5mL。

取上述樣品溶液分別用TITAN 的有機(jī)濾膜過(guò)濾，棄去初濾液1mL、3mL、5mL，取續(xù)濾液，作為樣品TITAN-棄1mL、TITAN-棄3mL、TITAN-棄5mL。

精密量取空白溶液、系統(tǒng)適用性溶液、離心樣品溶液及各個(gè)過(guò)濾樣品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖；考察濾膜對(duì)伊格列凈的吸附情況。結(jié)果見表6。

表6 濾膜吸附試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)論：由表6 可知美國(guó)PALL 有機(jī)濾膜、江蘇酷拓有機(jī)濾膜、TITAN 有機(jī)濾膜對(duì)伊格列凈的吸附量均在2%以內(nèi)，因此認(rèn)定以上三種濾膜對(duì)伊格列凈無(wú)吸附。