吳冬梅，劉倩，龔婷婷，陳秋燕，劉用誠

（福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003）

宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）是浸潤性宮頸癌的前期病變，分為低級別鱗狀上皮 內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）和高級別鱗狀上皮內(nèi)病變（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）。中醫(yī)辨治多從“帶下病”入手，主要證候為濕熱內(nèi)蘊［1－4］，主要治法為清熱祛濕［5－8］。有研究表明，在宮頸癌變進程中，miR－10b 可以通過靶向抑制HOXA1 基因發(fā)揮抑癌基因功能［9－12］。但濕熱證在宮頸病變不同病理級別中分布特征如何，在病變進展中是否發(fā)揮作用尚不清楚。本研究旨在通過研究宮頸病變不同病理級別中濕熱證的分布及中醫(yī)證候積分、miR－10b 的表達差異，為中醫(yī)藥防治本病提供理論依據(jù)。

1 臨床資料

1.1 一般資料

選取2020年7月—2021年7月就診于福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院宮頸癌早期防治工作室，經(jīng)宮頸三階梯診療程序篩查，宮頸病理檢查確診為LSIL、HSIL和早期宮頸癌的新發(fā)患者，共139例。

LSIL 組71 例，年齡25～57 歲，（39.20 ± 8.39）歲；HSIL組45例，年齡24～56歲，（41.11±8.04）歲；早期宮頸癌組23例，年齡26～51歲，（40.70±6.51）歲。3組患者一般情況經(jīng)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本課題經(jīng)福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核并批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫(yī)診斷標準

CIN 參照2014 版WHO 女性生殖系統(tǒng)腫瘤分類中宮頸病變的分類標準［13］。LSIL：鱗狀上皮基底及副基底樣細胞增生，細胞核極性輕度紊亂，有輕度異型性，核分裂象少，局限于上皮下1/3層，p16染色陰性或在上皮內(nèi)散在點狀陽性。HSIL：細胞核極性紊亂，核漿比例增加，核分裂象增多，異型細胞擴展到上皮下2/3 層甚至全層，p16在上皮大于2/3層面內(nèi)呈彌漫連續(xù)陽性。

宮頸癌診斷標準參考中國抗癌協(xié)會婦科腫瘤專業(yè)委員會發(fā)布的2021 版《子宮頸癌診斷與治療指南》［14］：早期宮頸癌指FIGO分期為Ⅰa2～Ⅱa2。

1.2.2 中醫(yī)辨證標準

參照談勇主編的第4 版《中醫(yī)婦科學》中“帶下病”的診斷方法和《中醫(yī)病證診斷療效標準》中的辨證分型擬定。并結(jié)合前期研究研制的陰道鏡影像表征證候望診調(diào)查表將濕熱證陰道鏡下征象納入辨證資料：宮頸分泌物色黃或膿性，宮頸病變部位顏色鮮紅，質(zhì)脆、易觸血，宮頸病變部位血管顏色鮮紅、質(zhì)地可以為細小、點狀［15－16］。

1.3 納入標準

①經(jīng)宮頸三階梯診療程序篩查，宮頸病理檢查確診為CIN，宮頸癌；②無放化療、免疫學治療病史；③不合并其他嚴重疾病如惡性腫瘤等，以免影響中醫(yī)辨證；④自愿參加并簽署知情同意書。

1.4 排除標準

①精神疾病患者，或合并其他全身性急、慢性疾病和患有其他惡性腫瘤者；②術(shù)后復(fù)發(fā)的宮頸病變、宮頸癌患者；③語言表達能力差，病情敘述有困難者；④拒絕配合者。

2 方法

2.1 中醫(yī)證候判定

按辨證標準將本病分為5 種證型：脾虛證、腎陽虛證、陰虛夾濕熱證、濕熱下注證和濕毒蘊結(jié)證。中醫(yī)辨證含濕熱證癥狀者即劃分為濕熱證組（可兼夾脾虛、腎虛、肝郁、熱毒），無濕熱證見癥者為非濕熱證組。

2.2 濕熱證中醫(yī)證候評分

應(yīng)用濕熱分級癥狀體征量化積分評定表將辨證含“濕熱證”的患者進一步根據(jù)癥狀體征進行中醫(yī)證候積分評定。濕熱證陰道鏡下征象納入積分。主證按無、輕、中、重依次計為0、3、6、9分，次證按無、輕、中、重依次計為0、1、2、3分。

2.3 實時熒光定量PCR 檢測法測定宮頸病變組織中miR－10b的含量

實時熒光定量PCR 檢測：采集宮頸病變組織，在1 mL 經(jīng)TRIZOL 試劑裂解的組織勻漿樣品中加入0.2 mL 氯仿進行兩相分離，對分離后的水相上層進行RNA 沉淀－清洗－干燥－溶解處理，獲得RNA 溶液。使用紫外線吸收法測定RNA質(zhì)量，Nano Drop ND－1000檢測RNA濃度和純度（濃度計算公式：A260×40 ng/μL；純度：RNA溶液A260/A280的比值）。利用Applied Biosystems引物設(shè)計軟件（Primer 5.0，ViiATM 7 Real－time PCR System）設(shè)計相應(yīng)的RNA引物，引物（RT primers）由英駿生物技術(shù)有限公司協(xié)助合成。應(yīng)用ViiATM 7 Real－Time PCR System 進行逆轉(zhuǎn)錄及PCR 反應(yīng)。miR－10b forward： AGCTGTTCAGTGCACTACAGA； miR－10b reverse：GTGCTACCCTGTAGAAC。

2.4 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行錄入及統(tǒng)計學處理。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。組間構(gòu)成比的比較采用卡方檢驗，計量資料滿足正態(tài)分布的多組比較采用方差分析，不滿足正態(tài)分布的采用非參數(shù)檢驗；以P＜0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 不同病理級別中濕熱證的分布特征

不同病理級別中濕熱證的構(gòu)成比比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。HSIL 組中濕熱證的構(gòu)成比高于LSIL組（P＜0.001），早期宮頸癌組中濕熱證的構(gòu)成比高于HSIL 組、LSIL 組（P＜0.001）。隨病理級別的增高，濕熱證分布增多。見表1。

表1 不同病理級別與濕熱證分布情況比較

3.2 不同病理級別中濕熱證中醫(yī)證候積分的比較

不同病理級別中濕熱證中醫(yī)證候積分比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。早期宮頸癌組高于HSIL組、LSIL 組（P＜0.01），HSIL 組高于LSIL 組（P＜0.01）。隨病理級別增高，濕熱證候中醫(yī)證候積分明顯增加。見表2。

表2 不同病理級別濕熱證候中醫(yī)證候積分比較

3.3 不同病理級別患者宮頸病變組織中的miR－10b表達量比較

不同病理級別患者宮頸病變組織中miR－10b 相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。與HSIL 組、LSIL 組比較，早期宮頸癌組miR－10b 表達量明顯降低（P＜0.05），與LSIL 組比較，HSIL 組miR－10b 表達量明顯降低（P＜0.001）。隨著宮頸病變病理級別加重，miR－10b表達呈下降趨勢。見表3。

表3 不同病理級別miR－10b表達水平

3.4 濕熱證候與miR－10b表達量相關(guān)性的比較

濕熱證組和非濕熱證組miR－10b 相對表達量差異有統(tǒng)計學意義，濕熱證組miR－10b表達量低于非濕熱證組（P＜0.05）。見表4。

表4 濕熱證組和非濕熱證組miR－10b表達量的比較

4 討論

宮頸上皮內(nèi)瘤變是宮頸癌變進程中的關(guān)鍵時期，是預(yù)防宮頸癌發(fā)生的重要靶點階段。中醫(yī)藥以其獨特的臨床辨證思維和多成分、多靶點的治療作用，在防治CIN方面極具優(yōu)勢。綜合本團隊前期和文獻研究可知，CIN屬于“帶下病”，最常見的證候因素是濕熱，濕熱內(nèi)蘊為主要證型；臨床采用清熱祛濕法有較好的防治作用［1－8］。但是目前對宮頸癌前病變的中醫(yī)病因病機研究還不夠深入，對濕熱在宮頸癌變進程中的作用機制尚不明了。

microRNA是非常重要的非編碼調(diào)控分子，它介導調(diào)控多細胞生物基因表達轉(zhuǎn)錄后水平，已證實許多miRNA與多種類型腫瘤的發(fā)生及發(fā)展相關(guān)，且在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用。有研究表明在宮頸癌變進程中，miR-10b 可通過靶向抑制HOXA1基因發(fā)揮抑癌基因功能，其表達量在宮頸上皮內(nèi)瘤變進展為癌的過程中逐漸下降，且差異顯著，可以作為宮頸病變惡性轉(zhuǎn)化的分子標志物［9－12］。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同病理級別中濕熱證構(gòu)成比有顯著差異，隨病理級別增高，濕熱證分布增多，在早期宮頸癌組中證型為濕熱證的患者高達100%，濕熱證的中醫(yī)證候積分也明顯增高。研究結(jié)果提示，隨著宮頸病變從LSIL 進展為HSIL，再到進展為宮頸癌，濕熱是其中的基本病理要素，發(fā)揮了重要作用，在CIN 發(fā)生發(fā)展中，濕熱是致病的始動因子，推動病變。

CIN 病位在宮頸，多由不潔性交，令濕熱內(nèi)襲陰器、胞宮，累積任帶，使任脈失固、帶脈失約所致。宮頸是胞宮出口，是排月經(jīng)、泌帶液、娩出胎兒的通道，是易于創(chuàng)傷之地，也是邪氣易于感染、伏藏之處。HR－HPV 通過不潔性交侵入人體，深伏于宮頸，可達1～2年，初時無明顯臨床癥狀體征，隨著病毒持續(xù)感染，濕熱濁邪不斷耗傷正氣，進而產(chǎn)生熱毒、痰瘀等病理產(chǎn)物。另一方面，由于機體長期被邪氣侵犯，正氣不足，不能托邪外出，濕熱邪毒結(jié)于胞宮子門，進一步加劇了宮頸病變發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的動態(tài)演變。“濕熱濁邪”是導致宮頸病變的主要病因，“濕熱積伏”胞宮是病變進展演變的主要病機。濕與熱結(jié)，“熱得濕而熱愈熾，濕得熱而濕愈橫”。因此，“除濕”“清熱解毒”在宮頸病變的“既病防變”過程中非常重要。

本研究進一步分析了宮頸病變不同病理級別中miR－10b的表達量以及濕熱證候與miR－10b表達量的相關(guān)性。結(jié)果顯示，隨著宮頸病變病理級別的加重，miR－10b的表達呈下降趨勢，這與鄒冬玲等［9－10］的研究結(jié)果一致，miR－10b 的表達差異可以反映宮頸癌變進展，是很有前景的分子學標志物。不僅如此，本次研究發(fā)現(xiàn)，miR－10b的表達也與濕熱證候有一定的相關(guān)性，濕熱證組的miR－10b表達量顯著低于非濕熱證組。宮頸癌前病變進展的本質(zhì)是HR－HPV持續(xù)感染，致癌基因和抑癌基因發(fā)生異常表達，誘導細胞周期調(diào)控異常，以致宮頸上皮細胞異常增殖。濕熱是促進宮頸病變進展的重要病理因素，基于此可以得出，濕熱必然是通過影響細胞周期調(diào)控，誘導宮頸上皮細胞異常增殖導致宮頸癌前病變進展的。其中可能的機制是濕熱邪毒可以抑制抑癌基因miR－10b表達，導致其靶向作用的mRNA表達異常，從而參與并調(diào)節(jié)宮頸癌發(fā)生與增殖過程。

本研究對宮頸上皮內(nèi)瘤變的基本病因病機做了初步探討，認為濕熱是促使宮頸癌變進展的重要病理要素，并且從分子生物學水平初步探討了濕熱致宮頸癌變的可能機制。目前國內(nèi)外未見相關(guān)報道，本研究為進一步深入研究宮頸癌前病變的病因病機提供了一定的理論基礎(chǔ)。