李紫瑞，邢瑩，胡玥，滕鈺浩，王瑞平

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

胃癌（gastric cancer，GC）是一種發(fā)病率高，病死率高的惡性腫瘤［1-2］。中國是全球胃癌發(fā)病率、病死率最高的地區(qū)，2015年國家疾控中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示：我國胃癌新發(fā)病例在各種惡性腫瘤中列第4 位（456.1/100 000），而在病死率方面，則高居第2 位（390.2/100 000）［3］。

胃癌具有早診率低、發(fā)病率高、轉(zhuǎn)移率高、病死率高的特點(diǎn)，多數(shù)患者需要接受化療、靶向治療為主的內(nèi)科治療，但治療有效率低是制約提高胃癌患者生存率的重要因素。20 世紀(jì)90年代以來胃癌的化療有效率停留在50%左右，未能有所突破，曲妥珠單抗、雷莫盧單抗和阿帕替尼等靶向藥物應(yīng)用于臨床僅僅給晚期患者帶來微弱的生存獲益，目前患者五年生存率仍低于20%。如何在“精準(zhǔn)醫(yī)療”指導(dǎo)下，提高胃癌療效是亟待解決的臨床問題。

中醫(yī)藥作為胃癌綜合治療的重要組成部分，可參與胃癌患者的治療全過程，具有有效、低毒的優(yōu)勢(shì)。但其中的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究，以期提供循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，更好地推廣應(yīng)用。

川楝子又名金鈴子，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦性寒有小毒，為楝科植物川楝（Melia toosendanSieb et Zucc）的果實(shí)，具有疏肝泄熱、行氣止痛、殺蟲的功效，主治脘腹脅肋疼痛，疝氣疼痛，蟲積腹痛，頭癬。由川楝子、延胡索組成《保命集》經(jīng)典名方金鈴子散，具有活血散瘀、行氣鎮(zhèn)痛的作用，在臨床上也用于惡性腫瘤的治療。川楝素（toosendanin）是從川楝中提取的一種三萜類成分，藥理作用廣泛，尤其具有廣譜的抗腫瘤藥理作用，已有學(xué)者證實(shí)川楝素能抑制肺癌細(xì)胞增殖［4］、侵襲轉(zhuǎn)移［5］，抑制肝癌細(xì)胞增殖［6］，誘導(dǎo)尤文氏肉瘤細(xì)胞凋亡［7］，逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞阿霉素耐藥［8］，具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，川楝素對(duì)胃癌細(xì)胞的影響少有探索。因此，本研究擬初步探索川楝素對(duì)人胃癌MKN-28 細(xì)胞的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人胃癌MKN－28細(xì)胞購自上海細(xì)胞庫。

1.2 藥物及試劑

川楝素（純度≥98%，四川省維克奇生物科技公司，批號(hào)：wkq－00131）；順鉑（cisplatin，DDP，大連美侖生物公司，批號(hào)：MB1055－S）；二甲亞砜（DMSO，美國Sigma 公司，批號(hào)：D2650－100ML）；胎牛血清（FBS，批號(hào)：A3160801）、胰酶（批號(hào)：25200－072）（美國Gibco公司）；RPMI－1640培養(yǎng)液（批號(hào)：G4530－500ML）、青鏈霉素雙抗（批號(hào)：G4003－100ML）（武漢賽維爾公司）；Hoechst 33258 染色試劑盒（杭州碧云天公司，批號(hào)：C0003）；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，合肥Biosharp 公司，批號(hào)：BS186－5 g）；GAPDH（批號(hào)：5174S）、Cleaved Caspase－3（批 號(hào)：9664S）、Cleaved－PARP（批 號(hào)：5625S）、p38（批號(hào)：8690S）和p－p38（批號(hào)：4511S）；一抗（美國Cell Signaling Technology 公司）；二抗（北京中杉金橋生物公司，批號(hào)：ZB－2306）。

1.3 主要儀器

HERAcell 1501型CO2培養(yǎng)箱、1300A2型生物安全柜（美國Thermo 公司）；ELX800 型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Bio－Tek 公司）；MP－4型電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀、CHEMIDOC XRS+伯樂凝膠成像儀（美國Bio－Rad 公司）；DS－Qi2正置熒光顯微鏡（日本NIKON公司）。

1.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析基于PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取川楝素的2D 和3D 結(jié)構(gòu)，通過上傳川楝素的3D 結(jié)構(gòu)圖至PharmMapper 網(wǎng)站（http：//www. lilab－ecust. cn/pharmmapper/）獲取川楝素的靶點(diǎn)。根據(jù)PharmMapper 網(wǎng)站所提供的靶點(diǎn)信息，在Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www. uniprot. org/）檢索出與蛋白靶點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的gene symbol。檢索GeneCards（http：//www. genecards. org/）數(shù)據(jù)庫和DisGeNET數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org），搜索與胃癌相關(guān)的疾病靶基因，將篩選出來的川楝素的作用靶點(diǎn)與胃癌疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲取共同靶點(diǎn)，通過String 數(shù)據(jù)庫（https：//www. string－db. org/）對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，使用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建藥物－靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖。將基因列表導(dǎo)入到KOBAS 3.0（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3）進(jìn)行KEGG 通路富集分析，并繪制藥物－靶點(diǎn)－通路－疾病網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

取人胃癌MKN－28 細(xì)胞株，置于RPMI－1640 培養(yǎng)液（含有10%胎牛血清培養(yǎng)液+1%青鏈霉素雙抗）中，于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁后長至80%～90%時(shí)進(jìn)行消化傳代，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.6 MTT實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長期的人胃癌MKN－28 細(xì)胞接種于96孔板中，每孔 接種6 × 103個(gè)，在CO2溫箱中培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)組每孔加入含不同濃度（3、1.5、0.75、0.375 μmol/L）川楝素的完全培養(yǎng)液，陽性參照組加入含5 mg/mL DDP 的完全培養(yǎng)液，空白對(duì)照組僅加入完全培養(yǎng)液。給藥24 h 后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入20 μL終濃度為5 mg/mL 的MTT 溶液。繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄去MTT 溶液，加入DMSO 溶液150 μL，振蕩5～10 min，嚴(yán)格避光操作，酶標(biāo)儀490 nm 處測(cè)OD 值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

抑制率=（1－實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值）×100%

1.7 Hoechst 33258染色實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長期的人胃癌MKN－28細(xì)胞，向預(yù)先放置了無菌蓋玻片的直徑60 mm培養(yǎng)皿中接種8×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 后加入含川楝素終濃度為1.5 μmol/L和0.75 μmol/L的完全培養(yǎng)液，陽性參照組加入含終濃度為5 mg/mL DDP 的完全培養(yǎng)液，加入陰性對(duì)照組僅加入完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。收集各組細(xì)胞玻片，以4% 的多聚甲醛固定，漂洗后以500 ng/mL 的Hoechst 33258 染色30 min，繼以PBS 漂洗2 次，以正置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞染色質(zhì)的變化。

1.8 Western Blot實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)及分組同Hoechst 33258 染色實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前先配好G－250 考馬斯亮藍(lán)溶液、10%分離膠和5%濃縮膠、上樣緩沖液、電泳緩沖液、轉(zhuǎn)膜緩沖液、TBST緩沖液、5%BSA 封閉液。Western Blot 步驟：①蛋白提?。虎诘鞍诐舛葴y(cè)定（Bradford 法）；③每個(gè)樣品取20 μg總蛋白上樣進(jìn)行SDS－PAGE 電泳；④轉(zhuǎn)膜；⑤免疫反應(yīng)；⑥凝膠圖像分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)處理

采用SPSS 26.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，經(jīng)t檢驗(yàn)符合正態(tài)分布者，以單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 川楝素靶點(diǎn)篩選及通路分析

通過PharmMapper 數(shù)據(jù)庫和Uniprot 數(shù)據(jù)庫篩選出川楝素的279 個(gè)潛在靶點(diǎn)，靶點(diǎn)信息見表1。檢索GeneCards 數(shù)據(jù)庫和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫，分別得到胃癌靶基因12 202個(gè)和3 806個(gè)，去除重復(fù)靶點(diǎn)3 363個(gè)，得到胃癌靶基因共12 578個(gè)。將川楝素靶基因與胃癌相關(guān)基因進(jìn)行映射，得到共同靶基因67個(gè)，見圖1。

表1 川楝素靶點(diǎn)信息表

圖1 川楝素治療胃癌的藥物－疾病共同靶點(diǎn)韋恩圖

將67個(gè)共同靶基因?qū)氲絊tring數(shù)據(jù)庫對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，根據(jù)得到的靶點(diǎn)相互作用關(guān)系表繪制藥物－靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2，設(shè)置節(jié)點(diǎn)大小反映Degree 值，紅線代表藥物和靶點(diǎn)之間的關(guān)系，藍(lán)線代表靶點(diǎn)蛋白之間的相互作用關(guān)系。圖中共有68 個(gè)節(jié)點(diǎn)，136 條邊，其中Degree 值較大者為INS、EP330、SOD2、ALDH18A1、FOXM1、ANXA1、SDHA、ACTA1（Degree值分別為18、12、8、7、6、6、6、6），表明這些蛋白是川楝素治療胃癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白，SHFM1 節(jié)點(diǎn)不是川楝素的靶基因，但與其他靶基因具有相互作用關(guān)系，其可能是川楝素治療胃癌潛在的靶基因。

圖2 川楝素－胃癌靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

對(duì)川楝素與胃癌的67 個(gè)共同靶蛋白進(jìn)行KEGG通路富集分析，得到164 條通路，排除如“Insulin signaling pathway”“Bladder cancer”“Parkinson disease”“Glioma”等與胃癌不相關(guān)的通路，最后確定了20 條通路，見表2，包括“Metabolic pathways”“Cell cycle”“Pathways in cancer”“TGF－beta signaling pathway”“NF－kappa B signaling pathway”等，并做出KEGG 通路富集分析圖，見圖3。富集分析結(jié)果顯示川楝素有關(guān)胃癌靶點(diǎn)主要作用于“Metabolic pathways”“Cell cycle”“Pathways in cancer”“TGF－beta signaling pathway”和“NFkappa B signaling pathway”相關(guān)通路，其中“Metabolic pathways”的富集因子（rich factor）最高，見圖3，根據(jù)靶點(diǎn)與信號(hào)通路之間的聯(lián)系，建立靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4，其中藍(lán)色菱形表示信號(hào)通路，綠色圓形表示疾病靶點(diǎn)，黑色連線表示靶點(diǎn)與通路之間的關(guān)系。富集于這20 條通路的靶基因有ACADS、ALAD、PRPS1、PRDX6、ALDH18A1、GSTZ1、SDHA、FBP1、DDC、BLVRA、SUOX、EP300、CUL1、E2F1、SKP1、CALML3、MMP2、PRKCQ、TAB1、BTK、CSNK1G1、PRKD2、INS、PTPRF，其中EP300、CUL1、INS、SKP1、CALML3、E2F1、TAB1 富集的通路較多，分別為8、6、6、5、4、4、3 條通路。

圖3 川楝素靶點(diǎn)KEGG信號(hào)通路富集分析

圖4 川楝素治療胃癌的藥物－靶點(diǎn)－通路－疾病網(wǎng)絡(luò)圖

表2 川楝素KEGG 通路富集

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果，初步推測(cè)含有INS、TAB1靶點(diǎn)蛋白的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路可能是川楝素治療胃癌的作用通路之一，因此進(jìn)一步設(shè)計(jì)分子生物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證川楝素治療胃癌的作用機(jī)制。

續(xù)表1

2.2 川楝素對(duì)人胃癌MKN－28細(xì)胞增殖的影響

不同濃度的川楝素作用于人胃癌MKN－28 細(xì)胞24 h 后，其抑制細(xì)胞增殖的抑制能力呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系，見圖5。在川楝素濃度到達(dá)3 μmol/L 時(shí)，抑制率達(dá)到（80.10 ± 0.70）%；即使在給藥濃度為0.375 μmol/L 時(shí)，其抑制率仍能達(dá)到（22.93 ± 1.03）%，與對(duì)照組相比仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其中川楝素3 μmol/L 組抑制率（80.10 ± 0.70）%與作為陽性參照的5 mg/mL 的DDP 效果（79.93 ± 0.78）%接近?；谝陨蠈?shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者初步判定川楝素是一種能夠高效抑制人胃癌MKN－28細(xì)胞增殖的藥物，具有潛在的研究?jī)r(jià)值，并確定了川楝素1.5、0.75 μmol/L作為后續(xù)機(jī)制探討的給藥濃度。

圖5 不同濃度川楝素對(duì)人胃癌MKN－28細(xì)胞增殖的影響

2.3 川楝素對(duì)人胃癌MKN－28細(xì)胞凋亡的影響

逃逸凋亡是惡性腫瘤的基本特征之一，而誘導(dǎo)凋亡是抗腫瘤藥物主要的藥理作用。凋亡過程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變，常被用來評(píng)判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。為進(jìn)一步明確川楝素是不是通過誘導(dǎo)凋亡來達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的藥理作用，筆者選用了Hoechst 33258染色法，從形態(tài)學(xué)角度觀察凋亡過程中染色質(zhì)的變化。

Hoechst 33258 是一種能夠特異性結(jié)合DNA 的活性染料，并能夠在正置熒光顯微鏡的紫外光激發(fā)下發(fā)射藍(lán)色熒光，從而特異性地標(biāo)記和反應(yīng)染色質(zhì)形態(tài)。細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變包括：Ⅰ期細(xì)胞核呈波紋狀或折縫樣，部分呈現(xiàn)固縮狀態(tài)；Ⅱa 期染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化，形成新月形；Ⅱb 期裂解為碎塊，形成凋亡小體。

筆者在鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白組中沒有明顯的腫瘤細(xì)胞凋亡的跡象，而與之相比，在經(jīng)不同濃度川楝素、DDP 處理24 h 后，給藥組細(xì)胞核染色質(zhì)出現(xiàn)了凋亡表現(xiàn)，包括染色體邊集形成新月形，甚至在川楝素3 μmol/L 組中觀測(cè)到了核破碎形成凋亡小體現(xiàn)象，從形態(tài)學(xué)上直觀地證實(shí)了川楝素能夠誘導(dǎo)胃癌MKN－28細(xì)胞發(fā)生凋亡。見圖6。

圖6 川楝素對(duì)人胃癌MKN－28細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響

2.4 川楝素對(duì)MKN－28 細(xì)胞Cleaved Caspase－3，Cleaved－PARP蛋白表達(dá)的影響

為了探索川楝素誘導(dǎo)凋亡背后的分子機(jī)制，筆者選擇Western Blot 實(shí)驗(yàn)觀察凋亡相關(guān)蛋白的改變。凋亡大體可分為內(nèi)源性凋亡和外源性凋亡，兩種途徑最終都以Caspase－3 活化，剪切PARP 為凋亡執(zhí)行階段標(biāo)志。用Western Blot 法檢測(cè)川楝素對(duì)MKN－28細(xì)胞Cleaved Caspase－3，Cleaved－PARP 蛋白的影響，結(jié)果見圖7。發(fā)現(xiàn)，人胃癌MKN－28 細(xì)胞受到不同濃度（1.5、3 μmol/L）的川楝素作用后，與空白組比較，Caspase－3活化形式（Cleaved Caspase－3）表達(dá)隨濃度升高而逐漸升高，而凋亡標(biāo)志性蛋白PARP 隨之被剪切為Cleaved－PARP。作為陽參的DDP 也能明顯地誘導(dǎo)以上兩種凋亡蛋白的表達(dá)上調(diào)。從蛋白層面上證實(shí)了川楝素能夠誘導(dǎo)胃癌MKN－28細(xì)胞凋亡。

圖7 川楝素對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5 川楝素對(duì)MKN－28 細(xì)胞p38、p－p38 蛋白表達(dá)的影響

調(diào)控信號(hào)通路是抗腫瘤藥物誘導(dǎo)凋亡的上游機(jī)制，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及診治中都具有重要作用，與腫瘤凋亡、自噬、侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥等關(guān)系密切，為此筆者用Western Blot 法檢測(cè)p38 MAPK 信號(hào)通路相關(guān)蛋白p38、p－p38，結(jié)果見圖8。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)p38及其磷酸化形式p－p38 的表達(dá)量，隨著川楝素給藥濃度的增加而上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖8 川楝素對(duì)MKN－28細(xì)胞p38、p－p38蛋白表達(dá)的影響

3 討論

胃癌的綜合治療手段包括手術(shù)、放療、化療、靶向治療和中醫(yī)藥治療等，其中手術(shù)及放療是針對(duì)局部病灶的治療手段，后三者可以起到全身治療的作用。但是由于胃癌細(xì)胞異質(zhì)性大等特點(diǎn)，胃癌化療有效率停滯在50%左右，缺乏有效率高的標(biāo)準(zhǔn)化療方案，造成了進(jìn)展期胃癌治療有效率低、復(fù)發(fā)率高及病死率高的臨床困境。近年來胃癌靶向治療方面都取得了一些進(jìn)步，雷莫盧單抗、阿帕替尼等靶向藥物的相繼問世，給臨床提供了更多治療手段，然而獲益人群主要局限于晚期胃癌患者，且獲益微弱。中醫(yī)藥可以貫穿腫瘤治療的全過程，并被證實(shí)有誘導(dǎo)凋亡、抑制侵襲轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等藥理機(jī)制，從而成為腫瘤治療的重要組成部分。川楝素作為一個(gè)從廣泛應(yīng)用的中藥川楝子中獲得的活性成分，近年來在抗腫瘤的研究中大放異彩。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)分析了川楝素治療人胃癌的作用靶點(diǎn)分子，篩選出川楝素作用于胃癌的主要靶點(diǎn)和信號(hào)通路，并通過中藥藥理及細(xì)胞分子實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，明確川楝素調(diào)控MAPK 信號(hào)通路治療胃癌，本項(xiàng)研究將兩者結(jié)合起來，具有一定的創(chuàng)新性和可行性。

凋亡，又稱為Ⅰ型程序性細(xì)胞死亡，凋亡逃逸是惡性腫瘤的十大特征［9］之一，而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡也是抗腫瘤藥物研發(fā)的主要思路。本研究中，通過Hoechst 33258染色法，從形態(tài)學(xué)角度證實(shí)人胃癌MKN－28細(xì)胞很少發(fā)生自發(fā)性的凋亡，具有凋亡逃逸的特征，但川楝素可以明顯地誘導(dǎo)其發(fā)生細(xì)胞凋亡，見圖6。

為明確相關(guān)分子機(jī)制，筆者檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)隨著給藥劑量的增加，凋亡標(biāo)志性蛋白Caspase－3 被活化成Cleaved Caspase－3，而PARP 隨之被剪切為Cleaved－PARP，見圖7。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果從分子層面提示，川楝素能誘導(dǎo)人胃癌MKN－28 細(xì)胞凋亡，并呈現(xiàn)濃度依賴性。

隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的逐步深入，信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用日益受到學(xué)界重視，成為抗腫瘤藥物研發(fā)的重要基礎(chǔ)。MAPK 通路在進(jìn)化上具有高度的保守性，決定了基于調(diào)節(jié)該通路的抗腫瘤藥物，可能在不同物種、瘤種上具有普適性。p38 MAPK作為MAPK 通路中的一支，從多維度調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展：調(diào)控細(xì)胞周期、分化、凋亡、自噬、侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥等［10-13］。因此，筆者選擇MAPK 信號(hào)通路，探索川楝素抗胃癌的分子機(jī)制，保證了本研究結(jié)果的普遍適用性。筆者觀察了川楝素對(duì)MAPK 通路的核心蛋白p38 及其磷酸化形式p-p38 的影響，基于實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷：川楝素可以劑量依賴性地激活MAPK通路。

通過本研究，可以得出以下結(jié)論：①川楝素能高效抑制人胃癌MKN－28細(xì)胞增殖；②川楝素是通過激活MAPK 通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮其抗腫瘤藥理作用。川楝素是一個(gè)具有進(jìn)一步研究?jī)r(jià)值的抗腫瘤藥物，后續(xù)可通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證其抗腫瘤藥理機(jī)制及其安全性。