杜京京，渠文瑞，張 錦，張文芳，陳薈冰

(1.鄭州輕工業(yè)大學，材料與化學工程學院，河南鄭州 450002；2.環(huán)境污染治理與生態(tài)修復河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450001)

0 引言

隨著納米科技的迅速發(fā)展，納米材料被廣泛應用于人類的生活和生產(chǎn)中，但其環(huán)境釋放量也日益增多[1]。納米材料主要通過實驗室及生產(chǎn)工廠的廢物排放、環(huán)境治理過程中的應用和納米產(chǎn)品的使用等途徑直接或間接地進入水體、大氣和土壤中[2]。水體是納米材料最終的富集地，納米材料進入水體后，不僅會對水生生態(tài)系統(tǒng)造成影響，還可能通過食物鏈在水生生物體內(nèi)富集并最終進入人體，對人類健康構成威脅[3]。研究表明，納米材料會促使機體產(chǎn)生氧化應激反應，導致靶器官炎癥，甚至透過細胞膜進入細胞和細胞核內(nèi)，將其本身的生物毒性放大[4,5]。納米材料對環(huán)境以及人類健康的潛在風險已引起了人們的廣泛關注。

納米氧化鋅作為一種新型基礎材料，由于其具有較大的比表面積和獨特的光電性能而被廣泛應用在建筑涂料、廢水處理、化妝品、塑料、陶瓷、醫(yī)療等各個領域中[6-9]。當前，納米氧化鋅的全球產(chǎn)量約為每年1×104t，但隨著對納米氧化鋅性能的開發(fā)，其需求量將會越來越大[10]。然而，納米氧化鋅的過度生產(chǎn)和不當使用導致其進入水環(huán)境中并富集，從而對細菌、藻類、魚類及浮游動物等多種水生生物產(chǎn)生毒害作用[11-15]。Bhuvaneshwari等[16]發(fā)現(xiàn)，將斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)暴露于納米氧化鋅中會導致斜生柵藻乳酸鹽脫氫酶含量的上升、酶活性的喪失以及大量活性氧的產(chǎn)生，并導致細胞形態(tài)的嚴重變形。但是，納米氧化鋅的毒性機制目前不明確，一般認為其毒性源于材料自身所特有的光催化活性[17]，也可能與其納米顆粒的性質(zhì)有關[18,19]。

真菌是淡水生態(tài)系統(tǒng)中主要的分解者，其在物質(zhì)循環(huán)和能量流動過程中發(fā)揮著極為重要的作用[20]。淡水生態(tài)系統(tǒng)中真菌的生理生態(tài)以及群落變化可作為生態(tài)系統(tǒng)是否健康的評價指標[21]。真菌能產(chǎn)生并分泌一系列胞外降解酶，以催化水體中的有機質(zhì)(如凋落物)降解，為腐食性水生動物提供適口性良好的養(yǎng)分。其中，最重要的降解酶是參與磷循環(huán)的酸性磷酸酶、參與氮循環(huán)的亮氨酸氨基肽酶、參與碳循環(huán)的纖維二糖水解酶和參與氧化過程的過氧化物酶，這些酶的活性變化反映了真菌生理生態(tài)狀態(tài)[22,23]。此外，pH條件是影響真菌生長的重要環(huán)境參數(shù)[24]，而真菌生理生態(tài)變化的最直觀表現(xiàn)是細胞吸水和物質(zhì)合成情況，即真菌鮮重和干重[25]。白地霉(Geotrichumcandidum)是一種廣泛存在于食物、廢水和土壤中的絲孢真菌，存在于不同的溪流中[26,27]。當毒性物質(zhì)存在時，白地霉的生態(tài)生理變化在一定程度上反映出淡水生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況。但是，目前有關納米氧化鋅對真菌影響的生態(tài)效應研究相對較少。

本研究以從水體凋落物上分離得到的白地霉作為研究對象，評估不同濃度納米氧化鋅對其培養(yǎng)環(huán)境pH、菌絲鮮重、菌絲干重以及胞外降解酶(酸性磷酸酶、亮氨酸氨基肽酶、纖維二糖水解酶、過氧化物酶)活性的影響效應，并探究納米氧化鋅對白地霉生長和代謝活性的影響機制，以期為納米材料生態(tài)安全性評估體系的建立提供有利的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 真菌分離和培養(yǎng)

實驗所用白地霉(GeotrichumcandidumAC1)分離于鉆天楊(PopulusnigralL.)凋落物。2018年夏季，采集濟源市天女溪沿岸鉆天楊(鉆天楊為河岸帶的優(yōu)勢物種)的新鮮落葉。帶回實驗室，用去離子水沖洗干凈，切成12 mm的圓盤，將凋落物圓盤放入0.5 mm孔徑的凋落物袋中，淹沒在溪流中(34°56′24.73″N，112°25′56.15″E)以進行微生物定殖。14 d后，將凋落物圓盤置于含有硫酸鏈霉素(16 μg/mL，Sigma-Aldrich)的100%麥芽汁固體培養(yǎng)基(130.1 g麥芽汁膏粉、20 g瓊脂和1 L超純水)上，30℃條件下培養(yǎng)2 d。采用D3390 Fungal DNA Mini Kit真菌DNA提取試劑盒(Omega Bio-Tek，Inc.)，對純化的菌株AC1進行DNA提取，使用通用引物ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對DNA的ITS片段進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序。

將分離純化的菌株AC1接種于100%麥芽汁固體培養(yǎng)基上，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后，用滅菌的打孔器在培養(yǎng)基上打孔得到菌盤，在10%麥芽汁液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d (30℃，150 r/min)，從而制得菌絲原液，保存于冰箱(4℃)待后續(xù)實驗使用。

1.1.2 納米氧化鋅

實驗所用納米氧化鋅為粒徑50 nm的粉末，購買于上海阿拉丁生物試劑公司。稱取0.4 g納米氧化鋅粉末并用超純水定容至100 mL。為使懸浮液中的納米顆粒均勻分散，每次使用前，將懸浮液置于4℃和40 KHz條件下用數(shù)控超聲波清洗器(KQ-100E，昆山市超聲儀器有限公司)振蕩30 min。利用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM，JSM-7001F)觀測納米氧化鋅的形貌，再使用Nano Measure 1.2標記FE-SEM圖像中的粒徑分布，得到懸浮液中納米氧化鋅的平均粒徑為(95±28) nm。

1.2 方法

取1 mL菌絲原液，加入含有40 mL 2%麥芽汁液體培養(yǎng)基的無菌錐形瓶中，再分別添加納米氧化鋅懸浮液使其最終濃度分別為0.1，0.5，1，5，10和20 mg/L，以不添加納米氧化鋅懸浮液的處理作為對照組，每個處理組和對照組重復3次。在30℃、150 r/min條件下培養(yǎng)真菌，分別于5 d(急性暴露)和10 d(慢性暴露)時取樣，測定其生長及代謝活性參數(shù)，包括培養(yǎng)環(huán)境pH、菌絲鮮重和干重，以及包括酸性磷酸酶、亮氨酸氨基肽酶、纖維二糖水解酶和過氧化物酶在內(nèi)的4種胞外降解酶的活性，具體測定方法如下。

1.2.1 培養(yǎng)環(huán)境pH

菌絲收集后，使用pH計(E-201-C，雷磁，中國上海)測量培養(yǎng)環(huán)境的pH值。pH計在使用前先進行清洗和校對，以確保誤差值最??；將pH復合電極插入待測溶液中，待其穩(wěn)定后讀取pH值。

1.2.2 菌絲鮮重和干重

用預先稱量過的紗布過濾真菌菌絲，用超純水輕柔地沖洗以去除附著在菌絲上的納米氧化鋅，然后用定性濾紙吸干多余水分，稱重至最精確的0.001 g，即為真菌鮮重。測定胞外降解酶活性(第1.2.3節(jié))后，將真菌菌絲在110℃下干燥24 h至恒重，稱重至最精確的0.001 g得到真菌干重。真菌鮮重(干重)表示為真菌在指定暴露時間(5 d或10 d)后的鮮重(干重)與初始鮮重(干重)比值的百分數(shù)。

1.2.3 胞外降解酶活性

根據(jù)Allison實驗室可見光酶標法[28]測定4種胞外降解酶活性，以評估白地霉參與磷循環(huán)(酸性磷酸酶)、碳循環(huán)(纖維二糖水解酶)、氮循環(huán)(亮氨酸氨基肽酶)和木質(zhì)素降解(過氧化物酶)過程中的代謝活性。往稱重后的新鮮菌絲加入3 mL pH值為5.0醋酸鈉緩沖液中，并置于加冰(4℃)的數(shù)控超聲波清洗器中于40 kHz條件下超聲30 min。將粗酶液在4℃、7 000 r/min條件下離心5 min，取其上清液加入相應的酶底物(表1)，于28℃、66 r/min搖床中分別培養(yǎng)45 min(酸性磷酸酶)、2 h(亮氨酸氨基肽酶和過氧化物酶)和4 h(纖維二糖水解酶)。使用酶標儀(Multiskan FC，Thermo Fisher)分別在405 nm(酸性磷酸酶，纖維二糖水解酶和亮氨酸氨基肽酶)和450 nm(過氧化物酶)處測定上述胞外降解酶的活性。在醋酸鈉緩沖液中稀釋1.00 μmol/mL的對硝基苯酚溶液得到一系列標準溶液。將0.75 mL不同濃度的標準液，0.075 mL 1.0 mol/L NaOH溶液和3 mL蒸餾水混合，分別測定吸光度，通過線性回歸得到標準曲線。胞外降解酶相對活性定義為第5天和第10天的酶活性與初始酶活性比值的百分數(shù)。

表1 胞外降解酶活性測定底物Table 1 Determination of substrate by extracellular degrading enzyme activity

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用單因素方差(LSD法)分析法檢驗培養(yǎng)環(huán)境pH及真菌生物量在各處理間的差異，采用雙因素方差分析法檢驗納米氧化鋅濃度和暴露時間的交互作用對胞外降解酶活性的影響。所有分析都在SPSS 18.0軟件中進行，顯著性水平為5%。

2 結果與分析

2.1 真菌鑒定結果

菌株AC1的菌落呈平面擴散狀,生長快，乳白色，毛絨狀，中心突起(圖1)。初步認定為絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，地霉屬。

圖1 菌株AC1的菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of strain AC1

該菌的ITS序列共376 bp，將序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對分析，與白地霉(Geotrichumcandidum)同源性達98.41%。通過真菌菌落形態(tài)[29,30]和ITS分子生物學[31]共同鑒定為白地霉(GeotrichumcandidumAC1，GenBank登錄號：MW332541)。

2.2 培養(yǎng)環(huán)境pH

通過單因素方差(LSD法)分析，納米氧化鋅暴露對白地霉生長培養(yǎng)環(huán)境的pH沒有顯著影響(P>0.05)。對照組中，白地霉生長的培養(yǎng)環(huán)境pH為2.82-2.89，添加納米氧化鋅后其培養(yǎng)環(huán)境pH為2.66-2.99 (圖2)。

不同字母表示不同處理之間存在顯著差異(P<0.05)Different letters represent significant difference under different treatment (P<0.05)圖2 納米氧化鋅對白地霉生長培養(yǎng)環(huán)境pH的影響Fig.2 Effects of nanosized zinc oxide on culture environment pH of Geotrichum candidum

2.3 真菌生物量

2.3.1 真菌鮮重

如圖3所示，暴露5 d時，0.1和0.5 mg/L納米氧化鋅對真菌鮮重沒有顯著影響(P>0.05)；與對照組相比，暴露于1和5 mg/L納米氧化鋅使真菌鮮重分別降低19.11%和9.17%，而暴露于10和20 mg/L納米氧化鋅使真菌鮮重分別增加6.46%和23.14%(P<0.05)。暴露10 d時，0.5和10 mg/L納米氧化鋅處理中真菌鮮重分別降低7.39%和15.92%，而5 mg/L納米氧化鋅處理下真菌鮮重顯著增加27.57%，在各處理中數(shù)值最高(P<0.05)。此外，在急性暴露下，1和5 mg/L納米氧化鋅對真菌鮮重有抑制作用，而10和20 mg/L納米氧化鋅對真菌鮮重有促進作用。但是在慢性暴露下，1和5 mg/L納米氧化鋅對真菌鮮重的影響分別為無顯著影響和促進作用，而10和20 mg/L納米氧化鋅分別為抑制作用和無顯著影響。

不同字母表示不同處理之間存在顯著差異(P<0.05)Different letters represent significant difference under different treatment (P<0.05)圖3 納米氧化鋅對白地霉鮮重的影響Fig.3 Effects of nanosized zinc oxide on Geotrichum candidum fresh weight

2.3.2 真菌干重

如圖4所示，暴露5 d時，與對照組相比，1和10 mg/L納米氧化鋅使真菌干重分別降低41.54%和36.01%，而其他濃度處理組使真菌干重提高12.69%-29.96% (P<0.05)。暴露10 d時，除0.5和1 mg/L，其他濃度處理組均使真菌干重顯著增加，提高15.01%-40.25%(P<0.05)。此外，隨著暴露時間由5 d延長至10 d，1和10 mg/L納米氧化鋅對真菌干重的影響由抑制作用分別轉變?yōu)闊o顯著影響和促進作用。

不同字母表示不同處理之間存在顯著差異(P<0.05)Different letters represent significant difference under different treatment (P<0.05)圖4 納米氧化鋅對白地霉干重的影響Fig.4 Effects of nanosized zinc oxide on Geotrichum candidum dry weight

2.4 胞外降解酶活性

雙因素方差分析結果表明(表2)，納米氧化鋅濃度、暴露時間以及二者的交互作用對酸性磷酸酶、亮氨酸氨基肽酶、纖維二糖水解酶和過氧化物酶活性均具有顯著影響(P<0.001)。

表2 納米氧化鋅濃度及暴露時間對胞外降解酶活性影響的雙因素方差分析Table 2 Two-way analysis of variance for extracellular degrading enzyme activities at nanosized zinc oxide concentrations and exposure time

2.4.1 酸性磷酸酶

如圖5所示，暴露5 d時，0.1 mg/L納米氧化鋅使酸性磷酸酶相對活性比對照組提高257.80% (P<0.05)；酸性磷酸酶相對活性隨著納米氧化鋅濃度的增加而降低，其中1-20 mg/L納米氧化鋅使該酶相對活性顯著降低158.96%-218.85% (P<0.05)。暴露10 d時，0.1-5 mg/L納米氧化鋅處理下，酸性磷酸酶相對活性相較于對照組顯著增加57.41%-270.26%，但隨著納米氧化鋅濃度(1-20 mg/L)的增加，該酶相對活性呈下降趨勢。納米氧化鋅濃度為1和5 mg/L，在急性暴露時表現(xiàn)為抑制作用，而慢性暴露時轉變?yōu)榇龠M作用(P<0.05)。

不同字母表示不同處理之間存在顯著差異(P<0.05)Different letters represent significant difference under different treatment (P<0.05)圖5 納米氧化鋅對酸性磷酸酶相對活性的影響Fig.5 Effects of nanosized zinc oxide on the relative activity of acid phosphatase

2.4.2 亮氨酸氨基肽酶

如圖6所示，暴露5 d時，0.1 mg/L納米氧化鋅使亮氨酸氨基肽酶相對活性顯著增加69.06% (P<0.05)；當納米氧化鋅濃度為20 mg/L時，該酶相對活性受到顯著抑制，相較于對照組降低45.75% (P<0.05)。暴露10 d時，1-10 mg/L納米氧化鋅導致亮氨酸氨基肽酶相對活性相較于對照組顯著增加15.64%-35.61%(P<0.05)，而其他處理組對該酶相對活性并無顯著影響。此外，隨著暴露時間由5 d延長至10 d，20 mg/L納米氧化鋅對該酶相對活性的抑制作用轉變?yōu)闊o明顯影響。

不同字母表示不同處理之間存在顯著差異(P<0.05)Different letters represent significant difference under different treatment (P<0.05)圖6 納米氧化鋅對亮氨酸氨基肽酶相對活性的影響Fig.6 Effects of nanosized zinc oxide on the relative activity of leucine-aminopeptidase

2.4.3 纖維二糖水解酶

如圖7所示，暴露5 d時，除0.1 mg/L處理組外，其他處理組使纖維二糖水解酶的相對活性顯著低于對照組(降低34.35%-55.57%，P<0.05)，且各處理之間沒有顯著性差異(P>0.05)。暴露10 d時，各濃度納米氧化鋅對該酶相對活性沒有顯著影響(P>0.05)。因此，當暴露時間延長時，真菌的纖維二糖水解酶對于納米氧化鋅有所適應。

不同字母表示不同處理之間存在顯著差異(P<0.05)Different letters represent significant difference under different treatment (P<0.05)圖7 納米氧化鋅對纖維二糖水解酶相對活性的影響Fig.7 Effects of nanosized zinc oxide on the relative activity of cellobiohydrolase

2.4.4 過氧化物酶

如圖8所示，暴露5 d時，0.1 mg/L納米氧化鋅處理下的過氧化物酶相對活性顯著高于對照組69.92%，而高濃度(5-20 mg/L)納米氧化鋅顯著抑制了該酶相對活性，且低于對照組25.26%-62.39% (P<0.05)。暴露10 d時，除0.5和1 mg/L納米氧化鋅對該酶相對活性沒有顯著影響(P>0.05)外，其他處理組均對該酶相對活性有顯著促進作用(37.87%-139.52%，P<0.05)。此外，當暴露時間由慢性(5 d)變?yōu)榧毙?10 d)時，高濃度(5-20 mg/L)納米氧化鋅對該酶相對活性的抑制作用轉變?yōu)榇龠M作用。

不同字母表示不同處理之間存在顯著差異(P<0.05)Different letters represent significant difference under different treatment (P<0.05)圖8 納米氧化鋅對過氧化物酶相對活性的影響Fig.8 Effects of nanosized zinc oxide on the relative activity of peroxidase

3 討論

納米氧化鋅的泄漏會對淡水生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生嚴重的破壞，針對納米氧化鋅造成的水體污染研究，已引起科研者的廣泛關注[32,33]。盡管許多研究已經(jīng)證明納米氧化鋅對水生生物及淡水生態(tài)系統(tǒng)功能的影響[7,32,34]，但仍缺乏納米氧化鋅對單一真菌生長和代謝活性的影響研究。

pH是影響微生物生長的重要生態(tài)因子[35]。通常，微生物都有其最適宜生長的pH值[36]。外界環(huán)境的pH一方面通過影響細胞膜蛋白以及胞外水解酶的活性，從而對細胞本身營養(yǎng)物的正常吸收與轉運產(chǎn)生影響；另一方面通過影響細胞對營養(yǎng)物的解離與吸收過程或細胞膜的表面電荷性質(zhì)及膜的通透性，進而對物質(zhì)的吸收能力產(chǎn)生影響[37]。本研究中納米氧化鋅的暴露不會對真菌生長的培養(yǎng)環(huán)境pH值產(chǎn)生影響，這表明納米氧化鋅不是通過影響培養(yǎng)環(huán)境pH值來影響白地霉的生長和代謝活性。

真菌鮮重用來表征其吸水情況，而干重用來衡量其物質(zhì)合成情況[22]。Yang等[38]通過對真菌鮮重和干重的評估，表明氧化石墨烯促進了白腐真菌的生長。本研究中，不同濃度納米氧化鋅對真菌鮮重和干重產(chǎn)生的影響具有差異性，表明真菌的吸水量和物質(zhì)合成對不同濃度下納米氧化鋅的響應不同。急性暴露下，納米氧化鋅對真菌吸水量表現(xiàn)為低濃度抑制而高濃度促進的整體影響，而慢性暴露下的影響不明顯。對于真菌物質(zhì)合成，無論急性和慢性暴露，0.1，5和20 mg/L納米氧化鋅表現(xiàn)為顯著的促進作用。不同的響應可能是納米氧化鋅對真菌生長的生態(tài)毒性和真菌對環(huán)境壓力適應性的綜合作用結果。

胞外降解酶活性用來衡量真菌的代謝活性和降解功能[39]。急性暴露下，納米氧化鋅對4種胞外降解酶活性的影響表現(xiàn)為低濃度促進而高濃度抑制。這種以低劑量刺激和高劑量抑制為特征的劑量反應關系被稱為毒物興奮效應[40]。這種毒物興奮效應可能是白地霉胞外降解酶系統(tǒng)應對環(huán)境脅迫的適應性反應[41]。在Du等[42]研究中發(fā)現(xiàn),納米氧化鋅在極低濃度(30 ng/L)下對于參與凋落葉分解的水生真菌的生物量具有刺激效應。綜合以上研究，推測白地霉的代謝活性對低濃度納米氧化鋅具有一定的適應性。然而這種適應性在高濃度情況下，特別是20 mg/L納米氧化鋅處理下是不存在的，反而表現(xiàn)為與碳、氮、磷循環(huán)有關的代謝活性和降解功能被顯著抑制。在時間維度上，隨著暴露時間的延長，高濃度納米氧化鋅暴露對胞外降解酶活性的抑制作用逐漸削弱，甚至轉變?yōu)榇龠M作用。例如，5-20 mg/L納米氧化鋅的急性暴露顯著抑制了酸性磷酸酶、亮氨酸氨基肽酶和過氧化物酶的相對活性，但隨著暴露時間的延長，納米氧化鋅對上述白地霉釋放的幾種酶的相對活性表現(xiàn)為無顯著影響或者促進作用。因此推測，納米氧化鋅慢性暴露可能會促使白地霉的胞外降解酶系統(tǒng)產(chǎn)生一定的適應性，從而使其代謝活性避免受到顯著影響。

4 結論

分析表明，納米氧化鋅暴露及其濃度變化對真菌培養(yǎng)環(huán)境的pH值無顯著影響，因此納米氧化鋅不是通過影響培養(yǎng)環(huán)境pH而影響真菌的生長和代謝活性。急性暴露下，真菌的吸水量和代謝活性對于納米氧化鋅的響應具有濃度差異性；而慢性暴露下，納米氧化鋅顯著促進了真菌的生長和代謝活性，表明隨暴露時間延長，真菌對納米氧化鋅產(chǎn)生了一定的適應性。本研究的成果有助于進一步了解納米氧化鋅的生態(tài)毒性，同時為揭示水生生態(tài)系統(tǒng)中真菌對毒性物質(zhì)污染物脅迫時的響應機制奠定了基礎。