楊海船,張赟赟**,張 穎,巫 凱,李 嘉

(1.廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院化學(xué)室，廣西南寧 530022； 2.廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530022)

0 引言

鉤藤為茜草科植物鉤藤Uncariarhynchophylla(Miq.) Miq.ex Havil.、大葉鉤藤UncariamacrophyllaWall.、毛鉤藤UncariahirsutaHavil.、華鉤藤Uncariasinensis(Oliv.) Havil.或無柄果鉤藤UncariasessilifructusRoxb.的干燥帶鉤莖枝，秋、冬二季采收，去葉，切段，曬干[1]，具有息風(fēng)定驚、清熱平肝的功效?，F(xiàn)代藥學(xué)研究表明，鉤藤主要具有鎮(zhèn)靜、降血壓、抗阿爾茨海默病和抗腫瘤等多種藥理作用[2-6]，吲哚生物堿是其主要的藥效物質(zhì)，其中大葉鉤藤主要含有鉤藤堿、異鉤藤堿、柯諾辛堿(Corynoxine)、柯諾辛堿B (Corynoxine B)等生物堿。

目前，有關(guān)鉤藤化學(xué)成分的研究主要集中于鉤藤堿和異鉤藤堿，對(duì)柯諾辛堿B和柯諾辛堿的研究相對(duì)較少。通過查閱文獻(xiàn)和抗腫瘤篩選實(shí)驗(yàn)證實(shí)，柯諾辛堿B及柯諾辛堿是鉤藤中很重要的抗腫瘤藥效物質(zhì)。因此，本研究建立了運(yùn)用HPLC同時(shí)測(cè)定柯諾辛堿B和柯諾辛堿的方法，并測(cè)定其在不同采收月份大葉鉤藤及其不同藥用部位中的含量，以期為鉤藤藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器

Waters alliance E2695型高效液相色譜儀(美國(guó)waters公司),BS110S型1/10萬電子分析天平(梅特勒公司),B2200s 超聲波清洗器(必能信超聲有限公司)。

1.1.2 主要試劑

鉤藤藥材采自廣西南寧市高峰林場(chǎng)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院黃云峰副研究員鑒定為大葉鉤藤(UncariamacrophyllaWall.)；柯諾辛堿(純度≥98，批號(hào)：BCY-0155)，柯諾辛堿B(純度≥98，批號(hào)：BCTG-0924)，均購(gòu)自江西佰草源生物科技有限公司；色譜純甲醇(美國(guó)Fisher公司)；水為超純水；其他試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：246 nm；柱溫：25℃；流動(dòng)相：甲醇-0.02%三乙胺(68∶32)；流速：1 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL。色譜圖見圖1。

1.柯諾辛堿 B;2.柯諾辛堿2.Corynoxine B;2.Corynoxine圖1 混合對(duì)照品溶液(a)和大葉鉤藤樣品(b)HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference solution (a) and Uncaria macrophylla Wall.(b)

1.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱定柯諾辛堿B和柯諾辛堿對(duì)照品適量，置于容量瓶?jī)?nèi)，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每1 mL分別含0.13,0.296 mg的混合對(duì)照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備

取大葉鉤藤藥材粗粉約1.0 g，精密稱量，置于具塞錐形瓶?jī)?nèi)，精密加入甲醇25 mL，密塞稱重，超聲提取40 min，放冷稱重并用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，用0.45 μm有機(jī)微孔濾膜濾過，制得供試品溶液。

1.2.4 耐用性試驗(yàn)

用Inertsil ODS-3 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Kromasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)等不同品牌色譜柱進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果本品供試液中柯諾辛堿B和柯諾辛堿色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)分別按柯諾辛堿B和柯諾辛堿色譜峰計(jì)算，均不低于3 000，表明本方法在不同色譜柱的適用性良好。

1.2.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取1.2.2節(jié)混合對(duì)照品溶液1，3，5，10，15 μL，按1.2.1節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積值(y)為縱坐標(biāo)，各待測(cè)物進(jìn)樣量(x)為橫坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 精密度試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，按1.2.1節(jié)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定各待測(cè)成分峰面積，峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于等于2.00%

1.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，于制備后0,1,2,6,10,18 h分別進(jìn)行測(cè)定，峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于等于3.00%

1.2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一樣品6份，每份約1.0 g，按1.2.3節(jié)方法制備供試品溶液，在1.2.1節(jié)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，每份供試品溶液平行進(jìn)樣2次，取平均值并計(jì)算供試品中各待測(cè)成分含量及其RSD。若待測(cè)成分含量為0.01%-0.10%，則RSD應(yīng)小于等于4.00%；若待測(cè)成分含量在0.10%-1.00%，則RSD應(yīng)小于等于3.00%。

1.2.9 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取已知含量(重復(fù)性實(shí)驗(yàn)樣品)的同一批鉤藤藥材6份，每份約0.5 g，分別置于具塞錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶中均精密加入7.00 mL混合對(duì)照品溶液(每1 mL混合對(duì)照品溶液含0.128 mg柯諾辛堿B，0.308 mg柯諾辛堿)和18.00 mL甲醇，按1.2.3節(jié)方法制備供試品溶液，在1.2.1節(jié)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。

回收率%=(C-A)/B×100%，

式中，A為供試品中所含被測(cè)成分的量，B為加入對(duì)照品的量，C為實(shí)測(cè)值。

1.2.10 樣品測(cè)定

精密稱取供試品適量，按1.2.3節(jié)方法制備供試品溶液，按1.2.1節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每份供試品溶液平行進(jìn)樣2次，取平均值并計(jì)算供試品中各待測(cè)成分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

由表1可知，各成分在各自的線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

表1 柯諾辛堿B和柯諾辛堿的線性關(guān)系考察結(jié)果Table 1 Results of linear relationship between corynoxine B and corynoxine

2.2 精密度試驗(yàn)

供試品溶液中柯諾辛堿B和柯諾辛堿峰面積的RSD (n=6)分別為0.86%、0.74%，表明儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

柯諾辛堿B和柯諾辛堿峰面積的RSD分別為2.05%、2.82%，表明供試品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

柯諾辛堿B和柯諾辛堿峰面積的RSD (n=6)分別為1.48%、2.23%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 加樣回收試驗(yàn)

由表2可知，供試品中柯諾辛堿B和柯諾辛堿的平均回收率(n=6)分別為99.47%和100.06%，RSD分別為1.56%和0.98%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表2 大葉鉤藤中2種生物堿的加樣回收率(n=6)Table 2 Recovery rates of two alkaloids in Uncaria macrophylla Wall.(n=6)

2.6 樣品測(cè)定

根據(jù)表3的結(jié)果可以看出，不同月份采收的大葉鉤藤中柯諾辛堿B和柯諾辛堿的含量呈現(xiàn)無明顯規(guī)律的波動(dòng)現(xiàn)象，其中，8月份采收的藥材中柯諾辛堿B和柯諾辛堿含量最高。

表3 柯諾辛堿B及柯諾辛堿含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Content determination results of corynoxine B and corynoxine

3 討論

2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》[1]規(guī)定鉤藤的藥用部位為帶鉤莖枝，采收季節(jié)為秋冬季節(jié)。鉤藤帶鉤莖枝在粉碎后常有較多纖維，很難繼續(xù)被粉碎成細(xì)粉，這些纖維主要存在于藥材的木質(zhì)部中。因此，筆者將其單獨(dú)取出，與過篩后的細(xì)粉分別測(cè)定其中柯諾辛堿B和柯諾辛堿的含量。結(jié)果顯示，細(xì)粉中柯諾辛堿B和柯諾辛堿的含量要明顯高于纖維中的含量，提示柯諾辛堿B和柯諾辛堿很可能主要存在于大葉鉤藤帶鉤莖枝的皮部，在木質(zhì)部中含量較低。帶鉤莖枝中的柯諾辛堿B含量明顯高于葉子，柯諾辛堿含量則略低于葉子，但兩個(gè)藥用部位中柯諾辛堿B和柯諾辛堿的含量之和卻相同，提示大葉鉤藤葉子可能也具有很好的藥用價(jià)值。這對(duì)于2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》[1]中關(guān)于“去葉”規(guī)定的合理性提出一定的思考。表3結(jié)果表明，8月份采收的藥材中柯諾辛堿B和柯諾辛堿含量最高，這對(duì)藥典規(guī)定“秋冬季節(jié)采收”提供一定的數(shù)據(jù)支撐。

根據(jù)2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》[1]記載，鉤藤項(xiàng)下只有1個(gè)薄層鑒別項(xiàng)，沒有含量測(cè)定項(xiàng)，質(zhì)量控制指標(biāo)還有所欠缺，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有待完善。隨著中藥現(xiàn)代化、國(guó)際化的發(fā)展，人們對(duì)藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提出了更高的要求，一個(gè)能體現(xiàn)藥材藥理學(xué)特征和優(yōu)良臨床價(jià)值的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系顯得越發(fā)重要，這就要求廣大科研工作者運(yùn)用各種技術(shù)，獲取藥材環(huán)境、遺傳、性狀、化學(xué)、藥理等特征數(shù)據(jù)[7]。

4 結(jié)論

本研究方法可準(zhǔn)確、快捷地測(cè)定大葉鉤藤中柯諾辛堿B和柯諾辛堿的含量，該結(jié)果可為大葉鉤藤的化學(xué)成分、適宜采收季節(jié)和藥用部位的研究提供科學(xué)數(shù)據(jù)。