李學(xué)堅(jiān)，銀江林，袁經(jīng)權(quán)**，蘇 健，趙小超，黎永紅，黃 艷，張?chǎng)┢G，張桂珍

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，廣西南寧 530222；2.那坡康正天然植物提取有限責(zé)任公司，廣西百色 533900；3.廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，廣西南寧 530022)

0 引言

左旋多巴(L-dopa)收載于世界各國(guó)藥典，在帕金森綜合癥的臨床治療中起十分重要的作用[1]。1961年Birkmayer發(fā)現(xiàn)L-dopa有抗帕金森綜合癥作用[2]，1968年美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床，1973年上市銷售，市場(chǎng)需求日漸增長(zhǎng)。L-dopa的生產(chǎn)途徑有化學(xué)合成法、生物酶催化法、生物發(fā)酵法和植物提取法。化學(xué)合成法因L-dopa和D-dopa手性拆分技術(shù)難度大，成本高，僅有歐洲、日本等發(fā)達(dá)國(guó)家采用；生物酶催化法和生物發(fā)酵法因技術(shù)不成熟，產(chǎn)量低，目前沒(méi)有量產(chǎn)；植物提取法因原料豐富易得，工藝簡(jiǎn)單，逐步成為主流[3]。植物提取法最初以蠶豆莢皮、蠶豆及藜豆為原料，后多采用貓豆；工藝也從酸提-鉛沉法[4]、稀醋酸法[5]發(fā)展到酸浸-離子交換法[6]。廣西以其貓豆資源優(yōu)勢(shì)，近二十年逐漸成為世界L-dopa的主要產(chǎn)區(qū)[7]，生產(chǎn)工藝為用稀HCl水溶液浸提，浸提液上001×7(732)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，將L-dopa富集于柱上；交換飽和后用水洗柱，再用濃氨水將L-dopa從柱上洗脫；洗脫液用HCl中和，減壓濃縮，析出粗品；粗品用稀HCl溶液加熱溶解至飽和，冷卻析出結(jié)晶，過(guò)濾，烘干，即得L-dopa產(chǎn)品[8]；用過(guò)的陽(yáng)離子交換柱，須用NaOH溶液和HCl溶液再生才能用于下一次交換。在上柱、洗柱及柱再生工序有大量工藝廢水產(chǎn)生；每生產(chǎn)1 kg L-dopa，可產(chǎn)生1.5-2.0 t高含淀粉、蛋白質(zhì)、HCl和NaOH的廢水，環(huán)保壓力大，所有傳統(tǒng)生產(chǎn)廠家因環(huán)境評(píng)價(jià)不合格而面臨關(guān)停。目前國(guó)內(nèi)外為解決L-dopa生產(chǎn)工藝排放黑臭廢水的研究鮮有報(bào)道。中國(guó)學(xué)者大多著重于新技術(shù)、新手段的應(yīng)用，如汪桂芳等[9]利用膜分離技術(shù)提高分離效果，楊衛(wèi)華[10]采用重組酪氨酸酚裂解酶催化合成左旋多巴。波蘭Polanowska等[11]為了環(huán)境保護(hù)和縮短工藝流程，嘗試用0.2%醋酸水為溶劑從蠶豆中提取左旋多巴，但只是完成實(shí)驗(yàn)室提取試驗(yàn)，沒(méi)有精制出產(chǎn)品，也沒(méi)有進(jìn)行工藝中試。

本研究摒棄傳統(tǒng)工藝，創(chuàng)新性地開(kāi)發(fā)一種新的生產(chǎn)工藝，雖然水的濃縮、蒸發(fā)量較大，但不產(chǎn)生含淀粉、蛋白質(zhì)、HCl和NaOH的廢水，能全面解決傳統(tǒng)工藝的黑、臭、高COD工業(yè)廢水問(wèn)題，且產(chǎn)品得率、產(chǎn)品質(zhì)量與傳統(tǒng)工藝相當(dāng)，可減少企業(yè)環(huán)保壓力。

1 材料與方法

1.1 儀器

Alliance 2695型四元泵帶紫外檢測(cè)器高效液相色譜儀(Waters公司)，GM705H型破壁料理機(jī)(上海飛利浦(中國(guó))投資有限公司)，HB43-S型水分測(cè)定儀(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)，DHG9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 材料

聚丙烯酰胺(PAM，非離子型，廣州東歌化工科技有限公司)；聚合氯化鋁(PAC，鞏義市碧波供水材料有限公司)；HCl、NaOH和MgCl2(西隴科學(xué)股份有限公司)；甲醇(Thermo Fisher)；維生素C(VC，東營(yíng)市華璇生物科技有限公司)；單寧酸(廣州市德晟化工有限公司)；蒙脫石(粵江新材料(廣州)有限公司)；食品級(jí)95%酒精(廣西崇左東亞糖業(yè)有限公司)；含量測(cè)定用試劑為色譜純，水為重蒸水；其余制劑為分析純。貓豆(又名狗爪豆)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定為豆科藜豆屬狗爪豆Mucunapruriens(Linn.) DC.var.Utilis (Wall.ex Wight) Bak.ex Burck的成熟、干燥種子[12]。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

常溫下用含VC水將干貓豆打成水漿，加PAM，靜置沉淀(第一次沉淀)，濾取濾液；濾液加熱煮沸，冷至室溫，加PAM，靜置沉淀(第二次沉淀)，濾取濾液，濃縮，靜置析出L-dopa粗品；濾取粗品，用pH值為3.5的HCl水溶液煮沸溶解至飽和，趁熱濾取濾液，冷卻，結(jié)晶析出L-dopa，濾取結(jié)晶，烘干得L-dopa原料藥產(chǎn)品。

1.3.2 供試液制備方法

1.3.2.1 含VC水的制備

常溫下操作，將1 g VC加入1 000 mL水中，充分?jǐn)嚢枋怪耆芙?；用HCl調(diào)節(jié)pH值為4.5-5.0。

1.3.2.2 PAM溶液的配制

取1 g非離子型PAM加入到1 000 mL去離子水中，快速攪拌使之全部溶解。即配即用。與料液(水漿或?yàn)V液)混合時(shí)，要快速、充分地?cái)嚢杈鶆颉?/p>

1.3.2.3 貓豆水漿的制備

常溫下操作，將含VC水和干貓豆一起放入破壁料理機(jī)中，不加熱，轉(zhuǎn)速7 500 r/min打漿10 min，得混懸狀水漿。

1.3.3 L-dopa含量測(cè)定

按《歐洲藥典》中提及的方法[13]進(jìn)行。

1.3.4 澄清效果測(cè)定

1.3.4.1 澄清效果指標(biāo)

在規(guī)定料液溫度下操作；先將料液與沉淀劑快速、充分地?cái)嚢杈鶆?，再保溫靜置至規(guī)定時(shí)長(zhǎng)，一次性倒入布氏漏斗，用2層Φ11 cm中速定性濾紙?jiān)?0.1 MPa真空度下抽濾10 min，測(cè)量濾液體積(VF)。

1.3.4.2 不同沉淀劑對(duì)澄清效果的影響

60 g貓豆，打成1 800 mL水漿，分成9等份，每份200 mL，分別與不同沉淀劑(各自預(yù)先溶于5 mL水)快速混勻，靜置，沉淀1 h，抽濾，測(cè)量濾液體積(VF)；取濾液測(cè)定L-dopa含量(C)。

1.3.5 基于貓豆原料的L-dopa轉(zhuǎn)移率計(jì)算

L-dopa轉(zhuǎn)移率T=(W產(chǎn)品×C產(chǎn)品)/(W原料×C原料)×100%，

式中：W產(chǎn)品為L(zhǎng)-dopa產(chǎn)品質(zhì)量；

C產(chǎn)品為L(zhǎng)-dopa產(chǎn)品中L-dopa的含量；

W原料為貓豆原料的質(zhì)量；

C原料為貓豆原料中L-dopa的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 操作溫度對(duì)水漿沉淀澄清的影響

預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，水漿溫度超過(guò)65℃，無(wú)論加入何種沉淀劑，水漿均呈大粘度的稀薄液體，難以過(guò)濾。因此工藝全部在室溫下操作，水漿溫度22-28℃。

2.2 不同沉淀劑對(duì)水漿沉淀澄清的影響

數(shù)據(jù)表明，不添加沉淀劑的水漿難以自然沉淀；加入PAC和PAM的沉淀效果最好。添加熟石膏粉、MgCl2、明礬、蒙脫石、PAC，水漿中L-dopa含量降低，且添加明礬、蒙脫石、PAC的水漿顏色變深；其余添加沉淀劑對(duì)水漿中的L-dopa 含量沒(méi)有影響(表1)。因此本工藝選用PAM作沉淀劑。

表1 不同沉淀劑對(duì)水漿沉淀效果的影響(x±s,n=3)Table 1 Effect of different precipitants on soymilk precipitation (x±s,n=3)

2.3 第一次沉淀工序的參數(shù)優(yōu)選

表2 第一次沉淀工序的因素和水平Table 2 Factors and levels of the 1st precipitation process

表3 第一次沉淀工序的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Test design and results of the 1st precipitation process

表4 第一次沉淀工序的方差分析Table 4 Variance analysis of the 1st precipitation process

極差分析顯示，因素影響大小為A>C>B，結(jié)果提示選A3B2C3。方差分析顯示，A有顯著影響(P<0.01)，B、C影響不明顯(P>0.05)。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素分析，A1→A2變化明顯(P<0.05)，A2→A3變化不明顯(P>0.05)，拐點(diǎn)在A2，因此選A3較妥；B、C因素變化拐點(diǎn)不明顯(P>0.05)，可結(jié)合實(shí)際情況選擇，越接近極差分析結(jié)果越佳。綜合考慮，選擇A3B2C2，即常溫下操作，1 kg貓豆用35 L含VC水磨成水漿；1 L水漿加0.15 g PAM，快速、充分?jǐn)嚢杌旌希仂o置1.5 h，即可進(jìn)行過(guò)濾。

2.4 第二次沉淀工序的參數(shù)優(yōu)選

采用L9(34)正交試驗(yàn)法。按第一次沉淀工序優(yōu)化參數(shù)制備濾液，將濾液加熱煮沸15-30 min，使水溶性蛋白和淀粉變性析出，冷卻降溫到所需溫度。沉淀劑仍選用PAM，PAM在超過(guò)65℃的水中會(huì)出現(xiàn)分解，因此考察溫度定為25-50℃。取煮沸后冷卻降溫的濾液9份，每份200 mL，按表5的用量和溫度操作，加入PAM溶液，快速攪拌混勻，保溫靜置沉淀一定時(shí)間，抽濾，測(cè)量濾液體積(VF)，結(jié)果如表6，方差分析結(jié)果如表7。

表5 第二次沉淀工序的因素和水平Table 5 Factors and levels of the 2nd precipitation process

表6 第二次沉淀工序的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 Test design and results of the 2nd precipitation process

表7 第二次沉淀工序的方差分析Table 7 Variance analysis of the 2nd precipitation process

極差分析顯示，因素的影響大小排序?yàn)锳>C>B，應(yīng)選A2B3C1。方差分析顯示，A影響非常顯著(P<0.01)，C影響顯著(P<0.05)，B影響不明顯(P<0.1)。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素分析，A1→A2變化明顯(P<0.05)，A2→A3變化不顯著(P>0.05)，拐點(diǎn)出現(xiàn)在A2，因此選A3較妥；B、C的變化拐點(diǎn)不明顯(P>0.05)。綜合考慮，選A3B3C1，即在室溫(25℃)下操作，1 L濾液加0.1 g PAM，快速攪拌混合，靜置2 h，即可進(jìn)行過(guò)濾。

2.5 濃縮工序參數(shù)的優(yōu)選

按第一、二次沉淀工序優(yōu)化參數(shù)制備8 000 mL濾液，分為8等份，各自減壓濃縮至不同體積，冷卻至室溫，靜置6 h，濾取結(jié)晶，烘干，稱重，含量測(cè)定，計(jì)算基于貓豆的L-dopa轉(zhuǎn)移率，結(jié)果如表8。數(shù)據(jù)表明，當(dāng)濃縮液體積是貓豆重量的2-2.5倍量時(shí)，L-dopa析出效果最好，過(guò)濾性亦佳。

表8 濃縮程度對(duì)結(jié)晶的影響Table 8 Effect of concentration degree on L-dopa crystallization

2.6 精制方法研究

沿用傳統(tǒng)工藝的成熟精制方法[14]。往耐酸容器中加入適量pH值為3.5的鹽酸水溶液(預(yù)先溶有3%的VC)，加熱至沸，加入L-dopa粗品溶解至飽和，加入粗品質(zhì)量4%的藥用級(jí)活性炭粉，攪拌，保溫40 min；趁熱濾取飽和液，自然冷卻至常溫，析出結(jié)晶；濾取結(jié)晶，干燥后得到L-dopa產(chǎn)品。

2.7 工藝中試驗(yàn)證

將本工藝在廣西那坡康正天然植物提取有限責(zé)任公司進(jìn)行3批中試生產(chǎn)，產(chǎn)品按《歐洲藥典》進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果如表9所示,工藝運(yùn)行平穩(wěn)，產(chǎn)品得率和產(chǎn)品質(zhì)量與傳統(tǒng)工藝相當(dāng)，工藝只產(chǎn)生少量含HCl的工業(yè)廢水。

表9 中試生產(chǎn)結(jié)果Table 9 Results of trial-production

3 討論

L-dopa不溶于乙醇、石油醚、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑；在水中微溶，常溫下600 mL水可溶解1 g[15]。預(yù)試驗(yàn)表明，貓豆其他成分對(duì)L-dopa有增溶作用，水中溶解度可超過(guò)3 mg·mL-1，因此只要有足量的水，貓豆磨成水漿10 min，豆中的L-dopa可溶解轉(zhuǎn)移入水中。L-dopa易溶于酸水，但如用pH<3.5強(qiáng)酸水提取，會(huì)因強(qiáng)酸水溶解太多雜質(zhì)而導(dǎo)致L-dopa無(wú)法從濃縮液中析出。

本工藝的技術(shù)難點(diǎn)在于盡可能減少提取液中的雜質(zhì)和提高產(chǎn)品得率。工藝采用室溫下水提、煮沸凝固析出水溶性淀粉和水溶性蛋白、加PAM沉淀劑等措施，目的是最大限度地減少提取液中的雜質(zhì)。貓豆皮含有大量纖維，是第一次沉淀過(guò)濾的良好助濾材料，但形成的濾渣含水率較高，帶走較多提取液；兩次PAM沉淀過(guò)濾，累計(jì)損失約15%提取液，相當(dāng)于損失約15%的L-dopa；濃縮析出粗品工序，有15%-20%的L-dopa殘留于母液，造成L-dopa的重大損失。沉淀、過(guò)濾、析出粗品工序尚有待優(yōu)化以提高L-dopa轉(zhuǎn)移率，最終提高產(chǎn)品得率。

在濃縮析出L-dopa工序的母液中尚含有少量L-dopa，可通過(guò)加入乙醇析出。工廠實(shí)際將母液直接烘干成為低含量L-dopa產(chǎn)品出售，既避免黑臭工藝廢水的產(chǎn)生，又省去防爆設(shè)備購(gòu)置及防爆車間建設(shè)。

酪氨酸是L-dopa產(chǎn)品的相關(guān)物質(zhì)之一，《歐洲藥典》要求其含量≤0.5%，《美國(guó)藥典》要求≤0.1%[16]。長(zhǎng)期的生產(chǎn)數(shù)據(jù)表明，L-dopa結(jié)晶母液的pH值越接近中性，結(jié)晶中酪氨酸含量越低。本工藝全程控制pH值為5-6，經(jīng)精制，產(chǎn)品中的酪氨酸含量很容易達(dá)到《中國(guó)藥典》和《歐洲藥典》要求，部分產(chǎn)品可達(dá)到《美國(guó)藥典》要求。

PAM能與分散于水溶液中的懸浮顆粒架橋、附著結(jié)團(tuán)，有極強(qiáng)的絮凝、沉淀作用，廣泛應(yīng)用于自來(lái)水生產(chǎn)、食品行業(yè)廢水處理等領(lǐng)域[17]。工藝使用PAM作沉淀劑，可確保毒性安全。貓豆水漿加熱至沸時(shí)，遇到MgCl2或熟石膏，水漿中的蛋白質(zhì)可凝固成豆腐狀，但過(guò)濾性不佳，濾餅含水率高，L-dopa損失大，因此沒(méi)有進(jìn)一步研究。

本工藝不產(chǎn)生黑、臭、高COD工業(yè)廢水，每生產(chǎn)1 kg L-dopa，僅產(chǎn)生10-20 L含HCl工藝廢水。試生產(chǎn)結(jié)果表明本工藝綠色環(huán)保，L-dopa產(chǎn)品得率可接受；沉淀濾渣可用于動(dòng)物飼料或生產(chǎn)淀粉、蛋白質(zhì)產(chǎn)品，貓豆資源可全部利用。濃縮工序的水蒸發(fā)量很大，將在后續(xù)研究中引進(jìn)膜分離技術(shù)去除大部分水后再進(jìn)行濃縮。此外，與貓豆同屬的蠶豆，其葉、花、幼果、成熟種子和根中的L-dopa含量均很高，尤以鮮葉(22.4 mg·g-1)為最[18]；作者后續(xù)研究將以葉、花、幼果和根為生產(chǎn)原料進(jìn)行試驗(yàn)，探究新工藝的通用性和可行性。

4 結(jié)論

本研究開(kāi)發(fā)的新生產(chǎn)工藝解決了傳統(tǒng)工藝的黑、臭、高COD工業(yè)廢水污染問(wèn)題，且產(chǎn)品得率和產(chǎn)品質(zhì)量與傳統(tǒng)工藝相當(dāng)，適合于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。