唐鳳鸞，顏小捷，梁英藝，孫菲菲，趙 健**

(1.廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所，廣西桂林 541006；2.中共羅定市龍灣鎮(zhèn)委員會，廣東羅定 527235；3.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西桂林 541001)

0 引言

走馬胎(ArdisiagigantifoliaStapf.)是紫金?？谱辖鹋俣嗄晟＞G灌木，具有祛風(fēng)壯骨、活血化淤、消腫止痛、止血生肌等功效。走馬胎干燥根系常用于治療風(fēng)濕痹痛、跌打損傷、產(chǎn)后血瘀、腹痛、癰疽瘡瘍[1-3]，葉片是西南地區(qū)藥浴的必備材料，可祛濕提神。從走馬胎根系中提取的三萜皂苷類、巖白菜素衍生物、揮發(fā)油等化合物[4-6]具有良好的抗炎、抗腫瘤和抗氧化作用[7,8]。市場上走馬胎多為野生資源，但隨著用量的迅速增加，資源破壞嚴(yán)重，已瀕臨滅絕[9-11]。為滿足市場需求，走馬胎的人工栽培面積不斷擴(kuò)大，但由于技術(shù)缺乏導(dǎo)致效果不佳。

生物量是產(chǎn)量形成的物質(zhì)基礎(chǔ)，在一定時期內(nèi)生物量隨生長年限延長而快速增加，成年后隨著生長力的下降生物量趨于穩(wěn)定[12]，但各器官生物量的變化存在物種、植株年齡及生長環(huán)境等差異[13-15]。多年生木本藥用植物有效成分一般都隨著植株生長年限的增長而增加，或達(dá)到一定程度后停止增加轉(zhuǎn)為下降[16]。例如:巴戟天水晶蘭苷含量隨著生長年限的增長而增加[17]，中國肉桂反式肉桂醛含量呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢[18]。因此，掌握植株年齡對藥用植物各器官生物量和有效成分的影響是高效栽培的關(guān)鍵技術(shù)之一。

現(xiàn)有研究主要集中于走馬胎的資源調(diào)查[9-11]、化合物和有效成分[5,19]、藥理和病理[7,8]、組織培養(yǎng)[20-22]等領(lǐng)域。有關(guān)走馬胎的栽培研究并不多見，且主要借助盆栽進(jìn)行研究。如周澤建等[23]研究上層樹種對走馬胎的化感作用；魏蓉[24]研究環(huán)境因子對走馬胎生物量和皂苷含量的影響。上述研究雖然對走馬胎栽培有一定的參考作用，但均未涉及栽培年限對走馬胎生物量和有效成分積累的系統(tǒng)研究。因此，本文以1-5年生走馬胎種子直播植株為對象，研究不同栽培年限對其根、莖、葉生長發(fā)育及有效成分含量的影響，探討走馬胎各器官生物量及有效成分積累的動態(tài)變化規(guī)律，為走馬胎藥材質(zhì)量控制和科學(xué)采收提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)域概況

試驗(yàn)區(qū)位于廣西壯族自治區(qū)桂林市恭城瑤族自治縣平安鄉(xiāng)，110°93′54″E，24°88′64″N，海拔330 m；年均氣溫19.7℃，年均降雨量1 437 mm，年平均相對濕度80%。樣地緩坡20°，上層樹種為杉木，郁閉度75%-85%;土壤類型為黑色砂質(zhì)土，土壤背景值見表1。

表1 試驗(yàn)區(qū)土壤檢測結(jié)果Table 1 Test results of soil in the test area

1.2 試驗(yàn)材料及生物量統(tǒng)計

2020年10月，選擇生長良好、無病蟲危害的1-5年生走馬胎種子直播植株，每個栽培年限隨機(jī)取樣10株，重復(fù)3次。卷尺測量株高，游標(biāo)卡尺測量基莖粗(離地面5 cm高的莖粗)，并統(tǒng)計葉片數(shù)量。采用全株挖掘的方法挖取植株，并根據(jù)走馬胎植株特點(diǎn)將其分為根、莖、葉3部分，做好標(biāo)簽。裝入封口袋帶回實(shí)驗(yàn)室，清洗干凈表面雜質(zhì)后晾干水分，105℃殺青30 min后70℃烘干至恒質(zhì)量，測量干質(zhì)量。

1.3 有效成分檢測

1.3.1 供試品溶液制備

分別將烘至恒質(zhì)量的樣品磨碎，過40目篩，精密稱取0.10 g，加50%甲醇10 mL超聲提取1 h，13 000 r·min-1離心5 min,上清液分別定容至10 mL，搖勻備用。

1.3.2 總皂苷含量測定

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

精密稱取齊墩果酸5.10 mg置10 mL 容量瓶中,加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.51 mg·mL-1的對照品溶液。分別精密吸取0，50，100，150，200 μL對照品溶液于試管中，60℃鼓風(fēng)吹干，加入5%香蘭素0.2 mL，高氯酸0.8 mL，保鮮膜封口,搖勻后置于60℃水浴15 min，自來水冷卻，迅速加入冰醋酸5 mL，保鮮膜封口搖勻，靜置5 min，以0 μL對照品溶液管作為空白對照，590 nm 波長下測定吸光度。以齊墩果酸含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得齊墩果酸含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程。

1.3.2.2 樣品中總皂苷含量測定

分別吸取供試品溶液0.1 mL注入試管，按照1.3.2.1節(jié)步驟測定樣品的吸光度，依據(jù)求得的回歸方程計算樣品總皂苷含量。

1.3.3 總酚含量測定

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

精密稱取沒食子酸10.4 mg置10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為1.04 mg·mL-1的對照品儲備液。精密吸取1 mL對照品儲備液置于10 mL 容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.104 mg·mL-1的對照品溶液。分別精密吸取0，40，80，120，160，200，240，400 μL對照品溶液于試管中，加入Folin試劑0.5 mL，混勻后靜置2 min，加入7.5%碳酸鈉溶液1.5 mL，加去離子水稀釋至5 mL，振蕩混勻，暗置30 min，以去離子水管作為空白對照，760 nm波長下測定吸光度。以沒食子酸含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得沒食子酸含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程。

1.3.3.2 樣品中總酚含量測定

分別吸取供試品溶液0.1 mL注入試管，按照1.3.3.1節(jié)步驟測定樣品的吸光度，并依據(jù)求得的回歸方程計算樣品總酚含量。

1.3.4 總黃酮含量測定

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

精密稱取蘆丁4.216 mg，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.421 6 mg·mL-1的對照品溶液。分別精密吸取0，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5 mL對照品溶液于試管中，加去離子水稀釋至5 mL，加入5%的亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻后靜置6 min，加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻后靜置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，搖勻后靜置30 min，以0 mL對照品溶液管作為空白對照， 495 nm波長下測定吸光度。以蘆丁含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得蘆丁含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到回歸方程。

1.3.4.2 樣品中總黃酮含量測定

分別吸取供試品溶液1 mL，注入試管，按照1.3.4.1節(jié)步驟測定樣品的吸光度，并依據(jù)求得的回歸方程計算樣品總黃酮含量。

1.4 結(jié)果計算

總生物量=根生物量+莖生物量+葉生物量，

根比重=根生物量/總生物量，

莖比重=莖生物量/總生物量，

葉比重=葉生物量/總生物量，

地上生物量比重=(莖生物量+葉生物量)/總生物量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用 Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并利用 SPSS 16.0 軟件進(jìn)行單因素差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 栽培年限對走馬胎植株生長的影響

由圖1可知，栽培年限對走馬胎植株高度、基莖粗及葉片數(shù)量均有顯著影響。株高和基莖粗隨栽培年限的延長顯著增加(P<0.05)，且增長節(jié)奏和變化趨勢非常相似，均為第2，3年處于趨勢線下方，第4，5年位于趨勢線上方，說明株高和基莖在第2，3年的增長速度較第4，5年低。走馬胎葉片數(shù)量由大到小依次為5年、4年、2年、1年、3年，其中第5年(14.11張)顯著高于1-4年(5.4-8.22張)(P<0.05)，第4年顯著高于1，3年(P<0.05)，1-3年變化不明顯。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)Different letters indicate significant differences (P<0.05)圖1 栽培年限對走馬胎植株形態(tài)指標(biāo)的影響Fig.1 Effect of planting years on the morphological indexes of A.gigantifolia Stapf.

2.2 栽培年限對走馬胎各器官生物量的影響

表2結(jié)果顯示，1-5年生走馬胎植株根、莖、葉生物量隨栽培年限延長顯著增加(P<0.05)，且增量由大到小依次為根、莖、葉。根、莖生物量增長速度最快出現(xiàn)在第4年，分別較前一年增加794%和719%，第5年最慢，僅為126%和154%；葉第2年最快，比第1年增加338%，之后均保持在130%左右。

表2 不同栽培年限對走馬胎各器官生物量的影響Table 2 Effects of different planting years on the biomass of each organ of A.gigantifolia Stapf.

2.3 栽培年限對走馬胎各器官物質(zhì)分配規(guī)律的影響

由表3可知，栽培年限可顯著影響走馬胎各器官生物量分配比(P<0.05)，但不同器官比重變化規(guī)律差異較大。根比重、地上部比重隨栽培年限延長變化無規(guī)律；莖、葉比重變化趨勢基本相反，莖比重隨栽培年限延長逐漸增加，葉比重隨栽培年限延長逐漸減小。根生物量占比較莖、葉高，占比0.30-0.51，最大值出現(xiàn)在第4年；莖、葉比重分別為0.15-0.41、0.11-0.46。

表3 不同栽培年限對走馬胎各器官生物量分配的影響Table 3 Effects of different planting years on biomass allocation of different organs of A.gigantifolia Stapf.

2.4 栽培年限對走馬胎各器官活性物質(zhì)含量的影響

由圖2可知，走馬胎各器官中活性物質(zhì)含量總體呈現(xiàn)根>葉>莖，且受栽培年限的影響較大。3年生走馬胎植株根、莖、葉的總皂苷含量最高，分別為3.14%、1.9%和1.52%；1年生莖、葉的總酚、總黃酮含量最高，分別為1.81%、2.96%和2.34%、3.11%;4年生根的總黃酮含量最高,為7.54%;其次為2年生根的總酚含量,為4.01%。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)Different letters indicate significant differences (P<0.05)圖2 不同栽培年限對走馬胎不同器官有效成分含量的影響Fig.2 Effects of different planting years on the content of effective components in different organs of A.gigantifolia Stapf.

3 討論

隨著栽培年限的延長，走馬胎株高、基莖粗，及根、莖、葉生物量均呈現(xiàn)顯著增加的變化趨勢，且根、莖生物量增長速度最快出現(xiàn)在第4年，說明栽培年限是影響走馬胎各器官生物量的重要因素。走馬胎地上部分生物量比重較大值出現(xiàn)在第2，3年，地下部分出現(xiàn)在第4，5年；莖生物量比重隨年限延長顯著增加，葉生物量則為減少。這與多年生植物隨著生長的進(jìn)行會分配更多的生物量到地上部分[25]，及白刺植株隨著生長的進(jìn)行會將更多的生物量分配給同化吸收器官而不是支持結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果[26]存在較大差異。究其原因，可能與所研究物種的生物學(xué)特性有關(guān)：走馬胎植株因無側(cè)枝生長而限制了莖、葉的增長空間，從而導(dǎo)致生長后期地上部分及同化器官葉片生物量比重的下降，同時根系生物量比重增加。

走馬胎不同器官中有效成分含量差異較大，總體呈現(xiàn)為根>葉>莖，這與傳統(tǒng)用藥習(xí)慣相符，說明走馬胎根系為其主要藥用部位具有科學(xué)依據(jù)。同時，栽培年限能明顯影響走馬胎不同器官的有效成分含量，但變化趨勢因成分類型不同存在明顯差異，這是因?yàn)椴煌煞值纳锖铣纱x途徑差異及代謝途徑中調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá)差異所致[27，28]。其中，抗腫瘤主要活性成分皂苷含量最高出現(xiàn)在第3年，且根、莖含量顯著高于其他年限，這與3年生柴胡、三七(Panaxnotoginseng)根中皂苷含量最高的結(jié)果[29-31]一致。但此結(jié)果在以皂苷類物質(zhì)為主要成分的藥用植物中是否具有普遍性還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

綜合走馬胎植株生長發(fā)育和生物量積累規(guī)律，及有效成分含量變化特點(diǎn)，可見走馬胎最佳藥用部位為根系，栽培3-4年采收比較合適。本研究結(jié)果可為走馬胎藥材使用和采收提供科學(xué)依據(jù)，具有較好的使用價值。